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Microfluídica digital

La microfluídica digital (DMF) es una plataforma para sistemas de laboratorio en un chip que se basa en la manipulación de microgotas. Las gotas se dispensan, mueven, almacenan,...

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La microfluídica digital (DMF) es una plataforma para sistemas de laboratorio en un chip que se basa en la manipulación de microgotas. Las gotas se dispensan, mueven, almacenan, mezclan, hacen reaccionar o analizan en una plataforma con un conjunto de electrodos aislados. [ 1 ] [ 2 ] La microfluídica digital se puede utilizar junto con procedimientos de análisis analítico como espectrometría de masas, colorimetría, electroquímica y electroquimioluminiscencia. [ 1 ]

Descripción general

Una gota acuosa sobre un sistema microfluídico abierto, con una vista en sección transversal. El diseño del dispositivo se puede adaptar a las necesidades del usuario (electrodos modificados, patrón de electrodos, materiales utilizados, etc.).[3][4]

De forma análoga a la microelectrónica digital, las operaciones microfluídicas digitales pueden combinarse y reutilizarse dentro de estructuras de diseño jerárquicas, de modo que los procedimientos complejos (por ejemplo, síntesis química o ensayos biológicos ) pueden construirse paso a paso. Y a diferencia de la microfluídica de flujo continuo , la microfluídica digital [ 3 ] funciona de manera muy similar a los protocolos de laboratorio tradicionales, solo que con volúmenes mucho menores y una automatización mucho mayor. Por lo tanto, una amplia gama de procedimientos y protocolos químicos establecidos pueden transferirse sin problemas a un formato de gota de nanolitros . La electromoja , la dielectroforesis y los flujos de fluidos inmiscibles son los tres principios más utilizados, que se han empleado para generar y manipular microgotas en un dispositivo microfluídico digital.

La configuración de un dispositivo microfluídico digital (DMF) depende de los sustratos utilizados, los electrodos, la configuración de esos electrodos, el uso de un material dieléctrico, el espesor de ese material dieléctrico, las capas hidrofóbicas y el voltaje aplicado. [ 4 ] [ 5 ]

Una gota acuosa se encuentra sobre un sistema microfluídico digital abierto y cerrado, con una vista en sección transversal. Esto muestra el movimiento de la gota una vez que se activa un electrodo. El diseño del dispositivo se puede adaptar a las necesidades del usuario (electrodos modificados, patrón de electrodos, materiales utilizados, etc.).[3][4]

Un sustrato común utilizado en este tipo de sistema es el vidrio. Dependiendo de si el sistema es abierto o cerrado, habrá una o dos capas de vidrio. La capa inferior del dispositivo contiene una matriz con patrón de electrodos controlables individualmente. [ 4 ] En un sistema cerrado, generalmente hay un electrodo de tierra continuo que atraviesa la capa superior, generalmente de óxido de indio y estaño ( ITO ). La capa dieléctrica se encuentra alrededor de los electrodos en la capa inferior del dispositivo y es importante para acumular cargas y gradientes de campo eléctrico en el dispositivo. [ 5 ] Se aplica una capa hidrofóbica a la capa superior del sistema para disminuir la energía superficial donde la gota estará en contacto. [ 5 ] El voltaje aplicado activa los electrodos y permite cambios en la humectabilidad de la gota sobre la superficie del dispositivo. Para mover una gota , se aplica un voltaje de control a un electrodo adyacente a la gota y, al mismo tiempo, se desactiva el electrodo justo debajo de la gota. Al variar el potencial eléctrico a lo largo de una matriz lineal de electrodos, se puede utilizar la electromoja para mover gotas a lo largo de esta línea de electrodos. [ 6 ]

También se pueden incorporar modificaciones a esta base en la estructura de diseño básica. Un ejemplo de esto es la adición de detectores de electroquimioluminiscencia dentro de la capa de óxido de indio y estaño (el electrodo de tierra en un sistema cerrado) que ayudan a la detección de luminóforos en gotas. [ 7 ] En general, también se pueden usar diferentes materiales para reemplazar componentes básicos de un sistema DMF, como el uso de PDMS en lugar de vidrio para el sustrato. [ 8 ] Se pueden agregar materiales líquidos, como aceite u otra sustancia, a un sistema cerrado para evitar la evaporación de materiales y disminuir la contaminación de la superficie. [ 6 ] [ 9 ] Además, los sistemas DMF pueden ser compatibles con gotas de líquido iónico mediante el uso de un aceite en un dispositivo cerrado o mediante el uso de una catena (un cable suspendido) sobre un dispositivo DMF abierto. [ 9 ]

La microfluídica digital puede activarse mediante luz. La optoelectromoción puede utilizarse para transportar gotas sésiles alrededor de una superficie que contiene fotoconductores con patrones . [ 10 ] El efecto de fotoelectromoción [ 11 ] también puede utilizarse para lograr el transporte de gotas en una oblea de silicio sin necesidad de electrodos con patrones. [ 12 ]

Principio de funcionamiento

Las gotas se forman utilizando las propiedades de tensión superficial de un líquido. Por ejemplo, el agua colocada sobre una superficie hidrofóbica como el papel encerado formará gotas esféricas para minimizar su contacto con la superficie. [ 13 ] Las diferencias en la hidrofobicidad de la superficie afectan la capacidad de un líquido para extenderse y "mojar" una superficie al cambiar el ángulo de contacto . [ 14 ] A medida que aumenta la hidrofobicidad de una superficie, aumenta el ángulo de contacto y disminuye la capacidad de la gota para mojar la superficie. El cambio en el ángulo de contacto, y por lo tanto la humectación, está regulado por la ecuación de Young-Lippmann. [ 4 ] [ 9 ] [ 5 ]

porque⁡(θ)=porque⁡(θ0)+ε0εrV22γd{\displaystyle \cos(\theta )=\cos(\theta {_{0}})+{\frac {\varepsilon {_{0}}\varepsilon {_{r}}V^{2}}{{2\gamma }d}}}

dóndeθ{\displaystyle \theta }es el ángulo de contacto con un voltaje aplicadoV{\displaystyle V};θ0{\displaystyle \theta {_{0}}}es el ángulo de contacto sin voltaje;εr{\displaystyle \varepsilon {_{r}}}es la permitividad relativa del dieléctrico;ε0{\displaystyle \varepsilon {_{0}}}es la permitividad del espacio libre ;γ{\displaystyle \gamma }es la tensión superficial del líquido/medio de relleno;d{\displaystyle d}es el espesor dieléctrico. [ 5 ]

En algunos casos, la hidrofobicidad de un sustrato se puede controlar mediante campos eléctricos. Esto se refiere al fenómeno de electromojeo sobre dieléctrico ( EWOD ). [3] [4] [ 5 ] Por ejemplo, cuando no se aplica un campo eléctrico a un electrodo, la superficie permanece hidrofóbica y una gota de líquido forma una gota más esférica con un mayor ángulo de contacto. Cuando se aplica un campo eléctrico, se crea una superficie hidrofílica polarizada. La gota de agua se aplana y el ángulo de contacto disminuye. Al controlar la localización de esta polarización, podemos crear un gradiente de tensión interfacial que permite el desplazamiento controlado de la gota a través de la superficie del dispositivo DMF. [ 6 ]

Formación de gotas

Hay dos maneras de crear nuevas gotas con un dispositivo microfluídico digital. Una gota existente puede dividirse en dos, o bien se puede crear una nueva gota a partir de un depósito de material. [ 15 ] Se sabe que ambos procesos solo funcionan en dispositivos cerrados, [ 9 ] [ 16 ] aunque esto no suele ser un problema, ya que las placas superiores de los dispositivos DMF suelen ser extraíbles, [ 17 ] por lo que un dispositivo abierto puede cerrarse temporalmente si es necesario formar gotas.

Una gota se divide en un dispositivo microfluídico digital. Inicialmente, la gota tiene forma esférica. Los electrodos cargados a cada lado tiran de ella en direcciones opuestas, formando una protuberancia de líquido en cada extremo con un cuello más delgado en el centro, similar a una mancuerna. A medida que se tira de los extremos, el cuello se adelgaza y, cuando ambos lados se encuentran, el cuello colapsa, formando dos gotas independientes, una en cada electrodo cargado.
Vista lateral y superior de una gota que se divide en un dispositivo DMF, donde se muestra la progresión del tiempo de izquierda a derecha.

A partir de una gota existente

Una gota puede dividirse cargando dos electrodos en lados opuestos de una gota sobre un electrodo sin carga. De la misma manera que una gota sobre un electrodo sin carga se moverá hacia un electrodo adyacente cargado, [ 6 ] esta gota se moverá hacia ambos electrodos activos. El líquido se mueve hacia cualquiera de los lados, lo que provoca que el centro de la gota se estreche. [ 15 ] Para una gota del mismo tamaño que los electrodos, la división ocurrirá aproximadamente cuandoRnortemidok/Rminorted=−1{\displaystyle R_{cuello}/R_{extremo}=-1}, ya que el cuello estará en su punto más delgado. [ 15 ]Rnortemidok{\displaystyle R_{neck}}es el radio de curvatura de los meniscos en el cuello, que es negativo para una curva cóncava, yRminorted{\displaystyle R_{end}}es el radio de curvatura de los meniscos en los extremos alargados de la gota. Este proceso es simple y produce consistentemente dos gotas de igual volumen. [ 15 ] [ 18 ]

El método convencional [ 19 ] [ 15 ] de dividir una gota existente simplemente encendiendo y apagando los electrodos de división produce nuevas gotas de volumen relativamente igual. Sin embargo, las nuevas gotas formadas por el método convencional muestran una diferencia considerable en el volumen. [ 20 ] [ 21 ] Esta diferencia es causada por perturbaciones locales debidas al rápido transporte de masa. [ 21 ] Aunque la diferencia es insignificante en algunas aplicaciones, aún puede representar un problema en aplicaciones que son altamente sensibles a las variaciones de volumen, [ 22 ] [ 23 ] como los inmunoensayos [ 24 ] y la amplificación de ADN. [ 25 ] Para superar la limitación del método convencional, una gota existente puede dividirse cambiando gradualmente el potencial de los electrodos en la región de división en lugar de simplemente encenderlos y apagarlos. [ 21 ] Utilizando este método, se ha informado una mejora notable en la variación del volumen de la gota, de alrededor del 10 % de variación de volumen a menos del 1 % de variación de volumen. [ 21 ]

Desde un embalse

La creación de una nueva gota a partir de un depósito de líquido puede realizarse de forma similar a la división de una gota. En este caso, el depósito permanece fijo mientras se utiliza una secuencia de electrodos para extraer líquido del mismo. Este líquido extraído y el depósito forman un cuello de líquido, similar al cuello de una gota que se divide, pero más largo, y el colapso de este cuello forma una gota dispensada a partir del líquido extraído. [ 15 ] [ 26 ] Sin embargo, a diferencia de la división, la dispensación de gotas de esta manera es inconsistente en escala y resultados. No existe una distancia fiable a la que se deba extraer el líquido del depósito para que el cuello colapse, si es que llega a colapsar. [ 27 ] Debido a que esta distancia varía, los volúmenes de gotas dispensadas también variarán dentro del mismo dispositivo. [ 27 ]

Debido a estas inconsistencias, se han utilizado y propuesto técnicas alternativas para dispensar gotas, incluyendo la extracción de líquido de depósitos en geometrías que fuerzan un cuello más delgado, [ 15 ] [ 28 ] el uso de un canal de electromojeo continuo y reabastecible, [ 22 ] y el desplazamiento de depósitos a esquinas para cortar el depósito por la mitad. [ 18 ] [ 28 ] Múltiples iteraciones de esto último pueden producir gotas de tamaños más manejables.

Manipulación de gotas

Fusión de gotas

Como una gota existente puede dividirse para formar gotas discretas usando electrodos (ver A partir de una gota existente ), [ 19 ] [ 15 ] las gotas también pueden fusionarse en una sola gota mediante electrodos. [ 29 ] [ 15 ] Utilizando el mismo concepto aplicado para crear nuevas gotas dividiendo una gota existente con electrodos, una gota acuosa que reposa sobre un electrodo sin carga puede moverse hacia un electrodo cargado donde las gotas se unirán y fusionarán en una sola gota. [ 29 ] [ 15 ] Sin embargo, la gota fusionada podría no formar siempre una forma circular incluso después de que el proceso de fusión haya terminado debido a la tensión superficial. [ 15 ] Este problema puede resolverse implementando una superficie superhidrofóbica entre las gotas y los electrodos. [ 29 ] Las gotas de aceite también pueden fusionarse de la misma manera, pero las gotas de aceite se moverán hacia electrodos sin carga a diferencia de las gotas acuosas. [ 30 ]

Transporte de gotas

Las gotas discretas pueden transportarse de forma altamente controlada utilizando una matriz de electrodos. [ 31 ] [ 32 ] [ 30 ] De la misma manera que las gotas se mueven de un electrodo sin carga a uno cargado, o viceversa, las gotas pueden transportarse continuamente a lo largo de los electrodos energizándolos secuencialmente. [ 33 ] [ 30 ] [ 15 ] Dado que el transporte de gotas implica una matriz de electrodos, se pueden programar varios electrodos para aplicar selectivamente un voltaje a cada uno de ellos para un mejor control sobre el transporte de múltiples gotas. [ 33 ]

Desplazamiento por actuación electrostática

La actuación tridimensional de gotas se ha hecho posible mediante la implementación de un sistema cerrado; este sistema contiene una gota de tamaño μL en un medio fluido inmiscible. La gota y el medio se colocan entre dos placas electromagnéticas, creando un campo EM entre ellas. [ 34 ] [ 35 ] El propósito de este método es transferir la gota de una superficie plana inferior a una superficie plana paralela superior y viceversa mediante fuerzas electrostáticas. [ 34 ] [ 36 ] La física detrás de dicha actuación de partículas y movimiento perpendicular se puede comprender a partir de los primeros trabajos de NN Lebedev e IP Skal'skaya. [ 37 ] En su investigación, intentaron modelar la carga eléctrica de Maxwell adquirida por una partícula conductora perfectamente redonda en presencia de un campo magnético uniforme causado por una superficie perfectamente conductora y de estiramiento infinito. [ 37 ] Su modelo ayuda a predecir el movimiento en la dirección Z de las microgotas dentro del dispositivo, ya que indica la magnitud y la dirección de las fuerzas que actúan sobre una microgota. Esto puede utilizarse para predecir y corregir con precisión el movimiento indeseado e incontrolable de partículas. El modelo explica por qué la falta de recubrimiento dieléctrico en una de las dos superficies provoca una inversión de carga dentro de la gota al entrar en contacto con cada electrodo, lo que a su vez causa que las gotas reboten de forma incontrolable entre ellos.

La microfluídica digital (DMF) ya se ha adaptado fácilmente en muchos campos biológicos. [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] Al permitir el movimiento tridimensional dentro de la DMF, la tecnología puede utilizarse aún más ampliamente en aplicaciones biológicas, ya que podría imitar con mayor precisión los microambientes 3D. Una gran ventaja de emplear este tipo de método es que permite que la gota acceda a dos entornos diferentes, lo que puede aprovecharse dividiendo las tareas microfluídicas entre las dos superficies. Por ejemplo, mientras que el plano inferior puede usarse para mover gotas, la placa superior puede llevar a cabo los procesos químicos y/o biológicos necesarios. [ 34 ] Esta ventaja puede traducirse en protocolos experimentales prácticos en la comunidad biológica, como el acoplamiento con la amplificación de ADN. [ 41 ] [ 36 ] [ 42 ] Esto también permite que el chip sea más pequeño y da a los investigadores más libertad para diseñar plataformas para el análisis de microgotas. [ 34 ]

Activación de gotas en todo terreno (ATDA)

La microfluídica todoterreno es un método utilizado para transportar gotas de líquido sobre tipos de superficies no tradicionales. [ 43 ] A diferencia de las plataformas de microfluídica tradicionales, que generalmente se limitan a superficies planas y horizontales, ATDA permite la manipulación de gotas sobre superficies curvas, no horizontales e invertidas. [ 43 ] Esto es posible gracias a la incorporación de láminas delgadas flexibles de cobre y poliimida en la superficie mediante un método de prototipado rápido . [ 43 ] [ 44 ] Este dispositivo funciona muy bien con muchos líquidos, incluidos tampones acuosos, soluciones de proteínas y ADN, y suero bovino sin diluir. [ 43 ] ATDA es compatible con aceite de silicona o aditivos plurónicos, como F-68, que reducen la absorción no específica y la bioincrustación cuando se trata de fluidos biológicos como proteínas, sueros biológicos y ADN. [ 43 ] [ 45 ] Una desventaja de una configuración como esta es la evaporación acelerada de las gotas. [ 43 ] ATDA es una forma de microfluídica digital abierta y, como tal, el dispositivo necesita ser encapsulado en un ambiente humidificado para minimizar la evaporación de las gotas. [ 46 ]

Implementación

En una de las diversas implementaciones de biochips microfluídicos basados ​​en EWOD, investigados por primera vez por Cytonix en 1987 [ 47 ] y posteriormente comercializados por Advanced Liquid Logic, hay dos placas de vidrio paralelas. La placa inferior contiene una matriz con un patrón de electrodos controlables individualmente y la placa superior está recubierta con un electrodo de conexión a tierra continuo . Se agrega un aislante dieléctrico recubierto con un material hidrofóbico a las placas para disminuir la humectabilidad de la superficie y agregar capacitancia entre la gota y el electrodo de control. La gota que contiene muestras bioquímicas y el medio de relleno, como aceite de silicona , un aceite fluorado o aire, se intercalan entre las placas y las gotas se desplazan dentro del medio de relleno. Para mover una gota , se aplica un voltaje de control a un electrodo adyacente a la gota y, al mismo tiempo, se desactiva el electrodo justo debajo de la gota. Al variar el potencial eléctrico a lo largo de una matriz lineal de electrodos, se puede utilizar la electromoja para mover gotas a lo largo de esta línea de electrodos.

Aplicaciones

Automatización de laboratorio

En campos de investigación como la biología sintética , donde la experimentación altamente iterativa es común, se han realizado esfuerzos considerables para automatizar los flujos de trabajo. [ 48 ] [ 49 ] [ 50 ] La microfluídica digital se promociona a menudo como una solución de automatización de laboratorio , con una serie de ventajas sobre soluciones alternativas como robots de pipeteo y microfluídica de gotas . [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ] Estas ventajas declaradas a menudo incluyen una reducción en el volumen requerido de reactivos experimentales, una reducción en la probabilidad de contaminación y contaminación cruzada, posibles mejoras en la reproducibilidad, mayor rendimiento, direccionamiento de gotas individuales y la capacidad de integrarse con módulos de sensores y detectores para realizar la automatización del flujo de trabajo de extremo a extremo o incluso de bucle cerrado. [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ] [ 54 ]

Huella experimental reducida

Una de las principales ventajas de la microfluídica digital, y de la microfluídica en general, es el uso y la manipulación de volúmenes a escala de picolitros a microlitros. Los flujos de trabajo adaptados del laboratorio a un sistema DMF se miniaturizan, lo que significa que los volúmenes de trabajo se reducen a fracciones de lo que normalmente se requiere para los métodos convencionales. Por ejemplo, Thaitrong et al. desarrollaron un sistema DMF con un módulo de electroforesis capilar (CE) con el propósito de automatizar el proceso de caracterización de bibliotecas de secuenciación de próxima generación (NGS) . En comparación con un Agilent BioAnalyzer (un instrumento comúnmente utilizado para medir la distribución del tamaño de las bibliotecas de secuenciación), el sistema DMF-CE consumió diez veces menos volumen de muestra. [ 55 ] Reducir los volúmenes para un flujo de trabajo puede ser especialmente beneficioso si los reactivos son caros o cuando se manipulan muestras raras como células tumorales circulantes y muestras prenatales. [ 53 ] La miniaturización también significa una reducción en los volúmenes de productos de desecho.

Probabilidad reducida de contaminación

Se ha demostrado que los flujos de trabajo basados ​​en DMF, en particular aquellos que utilizan una configuración cerrada con un electrodo de tierra en la placa superior, son menos susceptibles a la contaminación externa en comparación con algunos flujos de trabajo de laboratorio convencionales. Esto puede atribuirse a la mínima interacción del usuario durante los pasos automatizados y al hecho de que los volúmenes más pequeños están menos expuestos a contaminantes ambientales que los volúmenes más grandes, que tendrían que estar expuestos al aire libre durante la mezcla. Ruan et al. observaron una contaminación mínima por ADN exógeno no humano y ninguna contaminación cruzada entre muestras al utilizar su sistema de secuenciación digital del genoma completo basado en DMF . [ 53 ]

Reproducibilidad mejorada

Superar los problemas de reproducibilidad se ha convertido en un tema de creciente preocupación en todas las disciplinas científicas. [ 56 ] La reproducibilidad puede ser especialmente importante cuando se necesitan repetir múltiples iteraciones del mismo protocolo experimental. [ 57 ] El uso de robots de manipulación de líquidos que pueden minimizar la pérdida de volumen entre los pasos experimentales se utiliza a menudo para reducir las tasas de error y mejorar la reproducibilidad. Sinha et al. describieron un sistema DMF automatizado para la edición del genoma CRISPR-Cas9 , que se utilizó para cultivar y modificar genéticamente células de cáncer de pulmón H1299 . Los autores observaron que no se observó variación en las eficiencias de eliminación entre loci cuando las células se cultivaron en el dispositivo DMF, mientras que las células cultivadas en placas de pocillos mostraron variabilidad en las eficiencias de eliminación de loci río arriba. Esta reducción en la variabilidad se atribuyó a que el cultivo en un dispositivo DMF es más homogéneo y reproducible en comparación con los métodos de placas de pocillos. [ 58 ]

Mayor rendimiento

Si bien los sistemas DMF no pueden igualar el mismo rendimiento que algunos robots de pipeteo para manipulación de líquidos o algunos sistemas microfluídicos basados ​​en gotas, aún presentan ventajas en cuanto al rendimiento en comparación con los métodos convencionales realizados manualmente. [ 59 ]

Direccionamiento de gotas individuales

DMF permite la direccionabilidad a nivel de gota, lo que significa que las gotas individuales pueden tratarse como microrreactores espacialmente distintos . [ 51 ] Este nivel de control de gotas es importante para flujos de trabajo donde las reacciones son sensibles al orden de mezcla de reactivos y tiempos de incubación, pero donde aún puede ser necesario determinar los valores óptimos de estos parámetros. Este tipo de flujos de trabajo son comunes en biología libre de células , y Liu et al. pudieron demostrar una estrategia de prueba de concepto basada en DMF para llevar a cabo la expresión de proteínas libres de células controlada remotamente en un chip OpenDrop. [ 60 ]

Integración de módulos detectores para automatización de extremo a extremo y de circuito cerrado.

Una ventaja frecuentemente citada de las plataformas DMF es su potencial para integrarse con sensores en el chip y módulos detectores externos. [ 51 ] [ 60 ] En teoría, los datos en tiempo real y de punto final pueden utilizarse junto con métodos de aprendizaje automático para automatizar el proceso de optimización de parámetros.

Separación y extracción

La microfluídica digital puede utilizarse para la separación y extracción de analitos objetivo. Estos métodos incluyen el uso de partículas magnéticas, [ 61 ] [ 62 ] [ 63 ] [ 64 ] [ 65 ] [ 66 ] [ 67 ] [ 68 ] extracción líquido-líquido , [ 69 ] pinzas ópticas , [ 70 ] y efectos hidrodinámicos . [ 71 ]

partículas magnéticas

Para la separación de partículas magnéticas, se coloca una gota de solución que contiene el analito de interés sobre una matriz de electrodos microfluídicos digitales y se mueve mediante los cambios en las cargas de los electrodos. La gota se mueve hacia un electrodo con un imán en un lado de la matriz con partículas magnéticas funcionalizadas para unirse al analito. Luego se mueve sobre el electrodo, se elimina el campo magnético y las partículas quedan suspendidas en la gota. La gota se agita en la matriz de electrodos para asegurar la mezcla. Se reintroduce el imán y las partículas se inmovilizan, y la gota se retira. Este proceso se repite con tampones de lavado y elución para extraer el analito. [ 61 ] [ 62 ] [ 63 ] [ 64 ] [ 65 ] [ 66 ] [ 67 ] [ 68 ]

Se han utilizado partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti -albúmina sérica humana para aislar albúmina sérica humana, como prueba de concepto para la inmunoprecipitación mediante microfluídica digital. 5 También se ha realizado la extracción de ADN de una muestra de sangre completa con microfluídica digital. 3 El procedimiento sigue la metodología general de las partículas magnéticas, pero incluye un pretratamiento en la plataforma microfluídica digital para lisar las células antes de la extracción de ADN. [ 63 ]

Extracción líquido-líquido

Las extracciones líquido-líquido pueden realizarse en dispositivos microfluídicos digitales aprovechando los líquidos inmiscibles. 9 Dos gotas, una que contiene el analito en fase acuosa y la otra un líquido iónico inmiscible, se encuentran en la matriz de electrodos. Las dos gotas se mezclan y el líquido iónico extrae el analito, y las gotas se separan fácilmente. [ 69 ]

Pinzas ópticas

También se han utilizado pinzas ópticas para separar células en gotas. Se mezclan dos gotas en una matriz de electrodos: una con las células y la otra con nutrientes o fármacos. Las gotas se mezclan y, a continuación, se utilizan pinzas ópticas para desplazar las células hacia un lado de la gota más grande antes de dividirla. [ 72 ] [ 70 ] Para una explicación más detallada de los principios subyacentes, véase Pinzas ópticas .

separación hidrodinámica

Se han aplicado partículas para su uso fuera de la separación magnética, utilizando fuerzas hidrodinámicas para separar partículas del volumen de una gota. [ 71 ] Esto se realiza en matrices de electrodos con un electrodo central y "rebanadas" de electrodos que lo rodean. Se añaden gotas a la matriz y se agitan en un patrón circular, y las fuerzas hidrodinámicas de la agitación hacen que las partículas se agreguen al electrodo central. [ 71 ]

Síntesis química

La microfluídica digital (DMF) permite la manipulación y coordinación precisas en reacciones de síntesis química a pequeña escala debido a su capacidad para controlar volúmenes micrométricos de reactivos líquidos, lo que permite un menor uso y desperdicio de reactivos en general. [ 73 ] Esta tecnología se puede utilizar en la síntesis de compuestos como peptidomiméticos y trazadores PET . [ 74 ] [ 75 ] [ 76 ] Los trazadores PET requieren cantidades de nanogramos y, como tal, la DMF permite la síntesis automatizada y rápida de trazadores con una eficiencia del 90-95% en comparación con las técnicas macroscópicas convencionales. [ 75 ] [ 77 ]

Los reactivos orgánicos no se utilizan comúnmente en DMF porque tienden a mojar el dispositivo y causar inundaciones; sin embargo, la síntesis de reactivos orgánicos se puede lograr mediante técnicas de DMF transportándolos a través de una gota de líquido iónico, evitando así que el reactivo orgánico inunde el dispositivo. [ 78 ] Las gotas se combinan induciendo cargas opuestas, atrayéndolas entre sí. [ 79 ] Esto permite la mezcla automatizada de gotas. La mezcla de gotas también se utiliza para depositar cristales de MOF para impresión, suministrando reactivos en pocillos y evaporando las soluciones para la deposición de cristales. [ 80 ] Este método de deposición de cristales de MOF es relativamente económico y no requiere equipos robóticos complejos. [ 80 ]

La síntesis química mediante microfluídica digital (DMF) se ha aplicado a numerosas reacciones biológicas de gran relevancia. Estas incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), así como la formación de ADN y péptidos . [ 78 ] [ 81 ] La reducción, la alquilación y la digestión enzimática también han demostrado robustez y reproducibilidad utilizando DMF, lo que indica su potencial en la síntesis y manipulación de proteómica . [ 82 ] Los espectros obtenidos de los productos de estas reacciones suelen ser idénticos a sus espectros de referencia, utilizando solo una pequeña fracción de los reactivos a escala de laboratorio. [ 74 ] Por lo tanto, llevar a cabo estas síntesis a microescala ofrece la ventaja de limitar el gasto en reactivos y la generación de residuos, al tiempo que se obtienen resultados experimentales deseables. Sin embargo, es necesario superar numerosos desafíos para completar estas reacciones mediante DMF. Se han reportado casos de menor eficiencia en las reacciones químicas en comparación con las versiones a escala de laboratorio de las mismas síntesis, debido a la menor producción de productos. [ 81 ] Además, dado que se deben analizar muestras de tamaño picolitro y nanolitro, cualquier instrumento utilizado en el análisis debe tener una alta sensibilidad. Asimismo, la configuración del sistema suele ser difícil debido a la gran cantidad de cableado y bombas necesarias para operar los microcanales y depósitos. [ 81 ] Finalmente, las muestras suelen estar sujetas a la evaporación del disolvente, lo que provoca cambios en el volumen y la concentración de los reactivos y, en algunos casos, que las reacciones no se completen. [ 83 ]

La composición y pureza de las moléculas sintetizadas por DMF se determinan a menudo utilizando técnicas analíticas clásicas. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se ha aplicado con éxito para analizar los intermedios, productos y cinética de reacción correspondientes. [ 74 ] [ 84 ] Un problema potencial que surge al utilizar RMN es la baja sensibilidad de masa, sin embargo, esto se puede corregir empleando microbobinas que ayudan a distinguir moléculas de diferentes masas. [ 74 ] Esto es necesario ya que la relación señal/ruido de tamaños de muestra en el rango de microlitros a nanolitros se reduce drásticamente en comparación con tamaños de muestra a escala de laboratorio, y se ha demostrado que las microbobinas resuelven este problema. [ 85 ] La espectrometría de masas (EM) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) también se han utilizado para superar este desafío. [ 78 ] [ 74 ] Aunque la EM es una técnica analítica atractiva para distinguir los productos de reacciones realizadas a través de DMF, presenta sus propias debilidades. La espectrometría de masas con ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) y la espectrometría de masas con ionización por electrospray (ESI) se han combinado recientemente con el análisis de reacciones químicas microfluídicas. Sin embargo, la cristalización y la dilución asociadas a estos métodos suelen provocar efectos secundarios indeseables, como la pérdida de muestra y la aparición de reacciones secundarias. [ 17 ] El uso de la espectrometría de masas en DMF se analiza con más detalle en una sección posterior.

cultivo celular

La conexión del chip DMF para su uso en el campo o en interfaces del mundo al chip se ha logrado mediante bombas y depósitos manuales que suministran microbios, células y medios al dispositivo. [ 86 ] La ausencia de bombas y válvulas complejas permite aplicaciones elaboradas de múltiples pasos que involucran células, realizadas en un sistema simple y compacto. [ 59 ] En una aplicación, se transfirieron cultivos microbianos al chip y se les permitió crecer utilizando procedimientos estériles y la temperatura requerida para la incubación microbiana. Para validar que este era un espacio viable para el crecimiento microbiano, se llevó a cabo un ensayo de transformación en el dispositivo. [ 86 ] Esto implica exponer E. coli a un vector y someter a las bacterias a un choque térmico hasta que absorban el ADN. A continuación, se realiza una electroforesis en gel de ADN para asegurar que el vector deseado fue absorbido por las bacterias. Este estudio encontró que el ADN efectivamente fue absorbido por las bacterias y expresado como se predijo.

También se han manipulado células humanas en la inmunocitoquímica microfluídica digital en células individuales (DISC), donde se utilizaron plataformas DMF para cultivar y usar anticuerpos para marcar proteínas fosforiladas en la célula. [ 87 ] Luego, las células cultivadas se retiran del chip para su análisis. Otra técnica sintetiza hidrogeles dentro de plataformas DMF. Este proceso utiliza electrodos para suministrar reactivos para producir el hidrogel y suministrar reactivos de cultivo celular para su absorción en el gel. [ 76 ] [ 45 ] Los hidrogeles son una mejora con respecto al cultivo celular 2D porque el cultivo celular 3D tiene interacciones célula-célula aumentadas e interacciones célula-matriz extracelular. [ 45 ] Los cultivos celulares esféricos son otro método desarrollado en torno a la capacidad de DMF para suministrar gotas a las células. La aplicación de un potencial eléctrico permite la automatización de la transferencia de gotas directamente al cultivo celular suspendido. [ 76 ] ] [ 88 ] Esto es beneficioso ya que el cultivo celular tridimensional y los esferoides imitan mejor el tejido in vivo al permitir cultivos biológicamente más relevantes que tienen células creciendo en una matriz extracelular similar a la del cuerpo humano. [ 88 ] Otro uso de las plataformas DMF en el cultivo celular es su capacidad para realizar clonación in vitro sin células utilizando PCR de molécula única dentro de gotas. [ 89 ] Los productos amplificados por PCR se validan luego mediante transfección en células de levadura y una identificación de proteínas por Western blot. [ 89 ]

Los problemas derivados de las aplicaciones de cultivo celular que utilizan DMF incluyen la adsorción de proteínas en la superficie del dispositivo y la citotoxicidad para las células. Para evitar la adsorción de proteínas en la superficie de la plataforma, se utilizó aceite de silicona estabilizado con surfactante o hexano para recubrir la superficie del dispositivo, y se manipularon gotas sobre el aceite o hexano. [ 87 ] Posteriormente, el hexano se evaporó rápidamente de los cultivos para evitar un efecto tóxico en los cultivos celulares. [ 90 ] Otro enfoque para resolver la adhesión de proteínas es la adición de aditivos de Pluronic a las gotas en el dispositivo. [ 91 ] Los aditivos de Pluronic generalmente no son citotóxicos, pero se ha demostrado que algunos son dañinos para los cultivos celulares. [ 46 ]

La biocompatibilidad del dispositivo es importante para los análisis biológicos. Además de encontrar aditivos de Pluronic no citotóxicos, se logró crear un dispositivo cuyo voltaje y movimiento disruptivo no afectaran la viabilidad celular. Mediante la lectura de ensayos de viabilidad celular, se demostró que ni el voltaje necesario para mover las gotas ni el movimiento de los cultivos afectaban la viabilidad celular. [ 46 ]

Extracción biológica

Las separaciones biológicas suelen implicar muestras de baja concentración y alto volumen. Esto puede suponer un problema para la microfluídica digital debido al pequeño volumen de muestra necesario. [ 64 ] Los sistemas microfluídicos digitales pueden combinarse con un sistema macrofluídico diseñado para disminuir el volumen de la muestra, aumentando así la concentración del analito. [ 64 ] Sigue los mismos principios que las partículas magnéticas para la separación, pero incluye el bombeo de la gota para hacer circular un mayor volumen de fluido alrededor de las partículas magnéticas. [ 64 ] También se ha informado de la extracción de analitos de fármacos de muestras de orina seca. Una gota de disolvente de extracción, en este caso metanol, fluye repetidamente sobre una muestra de orina seca y luego se traslada a un electrodo final donde el líquido se extrae a través de un capilar y luego se analiza mediante espectrometría de masas. [ 92 ]

Inmunoensayos

Las avanzadas capacidades de manejo de fluidos de la microfluídica digital (DMF) permiten su adopción como plataforma de inmunoensayo , ya que los dispositivos DMF pueden manipular con precisión pequeñas cantidades de reactivos líquidos. Se han desarrollado inmunoensayos heterogéneos (antígenos que interactúan con anticuerpos inmovilizados) y homogéneos (antígenos que interactúan con anticuerpos en solución) utilizando una plataforma DMF. [ 93 ] En cuanto a los inmunoensayos heterogéneos, la DMF puede simplificar los pasos procedimentales extensos e intensivos al realizar todos los pasos de suministro, mezcla, incubación y lavado en la superficie del dispositivo (en el chip). Además, se han incorporado a las plataformas de inmunoensayo DMF técnicas y métodos de inmunoensayo existentes, como los ensayos basados ​​en perlas magnéticas, ELISA y detección electroquímica. [ 94 ] [ 95 ] [ 96 ] [ 97 ]

Se ha demostrado la incorporación de ensayos basados ​​en microesferas magnéticas en una plataforma de inmunoensayo DMF para la detección de múltiples analitos, como insulina humana, IL-6 , marcador cardíaco troponina I (cTnI), hormona estimulante de la tiroides (TSH), sTNF-RI y 17β-estradiol. [ 96 ] [ 98 ] [ 99 ] [ 100 ] Por ejemplo, se ha utilizado un enfoque basado en microesferas magnéticas para la detección de cTnI a partir de sangre total en menos de 8 minutos. [ 98 ] Brevemente, las microesferas magnéticas que contenían anticuerpos primarios se mezclaron con anticuerpos secundarios marcados, se incubaron y se inmovilizaron con un imán para los pasos de lavado. Luego, la gota se mezcló con un reactivo quimioluminiscente y la detección de la reacción enzimática acompañante se midió en el chip con un tubo fotomultiplicador .

La plantilla ELISA, comúnmente utilizada para realizar inmunoensayos y otros ensayos bioquímicos basados ​​en enzimas, se ha adaptado para su uso con la plataforma DMF para la detección de analitos como IgE e IgG. [ 101 ] [ 102 ] En un ejemplo, [ 94 ] se realizó una serie de bioensayos para establecer las capacidades de cuantificación de los dispositivos DMF, incluyendo un inmunoensayo basado en ELISA para la detección de IgE. Se inmovilizaron nanopartículas superparamagnéticas con anticuerpos anti-IgE y aptámeros marcados con fluorescencia para cuantificar IgE utilizando una plantilla ELISA. De manera similar, para la detección de IgG, la IgG se puede inmovilizar en un chip DMF, conjugar con IgG marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) y luego cuantificar mediante la medición del cambio de color asociado con la formación del producto de la reacción entre HRP y tetrametilbencidina. [ 101 ]

Para ampliar aún más las capacidades y aplicaciones de los inmunoensayos DMF más allá de la detección colorimétrica (es decir, ELISA, ensayos basados ​​en perlas magnéticas), se han incorporado herramientas de detección electroquímica (por ejemplo, microelectrodos) en chips DMF para la detección de analitos como TSH y virus de la rubéola. [ 97 ] [ 103 ] [ 104 ] Por ejemplo, Rackus et al. [ 103 ] integraron microelectrodos en la superficie de un chip DMF y sustituyeron un inmunoensayo quimioluminiscente de IgG previamente informado [ 105 ] con una especie electroactiva, lo que permitió la detección del virus de la rubéola. Recubrieron perlas magnéticas con virus de la rubéola, IgG antirrubéola e IgG antihumana acoplada con fosfatasa alcalina, que a su vez catalizó una reacción de transferencia de electrones que fue detectada por los microelectrodos en el chip.

Espectrometría de masas

El acoplamiento de la microfluídica digital (DMF) y la espectrometría de masas se puede clasificar en gran medida en análisis indirecto fuera de línea, análisis directo fuera de línea y análisis en línea [ 17 ] y las principales ventajas de este acoplamiento son la disminución del uso de disolventes y reactivos, así como la disminución de los tiempos de análisis. [ 106 ]

El análisis indirecto fuera de línea consiste en el uso de dispositivos DMF para combinar reactivos y aislar productos, que luego se extraen y se transfieren manualmente a un espectrómetro de masas. Este método aprovecha el DMF para la preparación de la muestra, pero también introduce oportunidades de contaminación, ya que se requiere intervención manual para transferir la muestra. En un ejemplo de esta técnica, se llevó a cabo una condensación de tres componentes de Grieco en un chip y se extrajo del chip con una micropipeta para su desactivación y posterior análisis. [ 78 ]

El análisis directo fuera de línea es el uso de dispositivos DMF que han sido fabricados e incorporados parcial o totalmente en un espectrómetro de masas. Este proceso todavía se considera fuera de línea, sin embargo, ya que algunos procedimientos posteriores a la reacción pueden llevarse a cabo manualmente (pero en el chip), sin utilizar las capacidades digitales del dispositivo. Estos dispositivos se utilizan con mayor frecuencia en combinación con MALDI-MS . En los dispositivos directos fuera de línea basados ​​en MALDI, la gota debe secarse y recristalizarse junto con la matriz, operaciones que a menudo requieren cámaras de vacío. [ 17 ] [ 107 ] El chip con el analito cristalizado se coloca luego en el MALDI-MS para su análisis. Un problema que surge con el acoplamiento de MALDI-MS a DMF es que la matriz necesaria para MALDI-MS puede ser altamente ácida, lo que puede interferir con las reacciones en el chip [ 108 ]

El análisis en línea es el uso de dispositivos que alimentan directamente a los espectrómetros de masas, eliminando así cualquier manipulación manual. El análisis en línea puede requerir dispositivos fabricados especialmente y hardware de conexión entre el dispositivo y el espectrómetro de masas. [ 17 ] El análisis en línea a menudo se acopla con la ionización por electrospray . En un ejemplo, se fabricó un chip DMF con un orificio que conducía a un microcanal [ 109 ] Este microcanal, a su vez, estaba conectado a un ionizador de electrospray que emitía directamente a un espectrómetro de masas. La integración de técnicas de ionización ambiental donde los iones se forman fuera del espectrómetro de masas con poco o ningún tratamiento se combina bien con la naturaleza microfluídica abierta o semiabierta del DMF y permite un acoplamiento en línea fácil entre los sistemas DMF y MS. Las técnicas de ionización ambiental como la ionización por ondas acústicas superficiales (SAW) generan ondas superficiales en una superficie piezoeléctrica plana que imparten suficiente energía acústica en la interfaz líquida para superar la tensión superficial y desorber iones del chip hacia el analizador de masas. [ 110 ] [ 17 ] Algunos acoplamientos utilizan una fuente de pulsos de alto voltaje externa en la entrada física del espectrómetro de masas [ 111 ] pero el verdadero papel de tales adiciones es incierto. [ 112 ]

Una barrera significativa para la integración generalizada de DMF con espectrometría de masas es la contaminación biológica, a menudo denominada bioincrustación. [ 17 ] El análisis de alto rendimiento es una ventaja significativa en el uso de sistemas DMF, [ 106 ] pero significa que son particularmente susceptibles a la contaminación cruzada entre experimentos. Como resultado, el acoplamiento de DMF con espectrometría de masas a menudo requiere la integración de una variedad de métodos para prevenir la contaminación cruzada, tales como múltiples pasos de lavado, [ 113 ] [ 114 ] surfactantes biocompatibles, [ 115 ] y/o superficies superhidrofóbicas para prevenir la adsorción de gotas. [ 116 ] [ 117 ] En un ejemplo, una reducción en la señal de contaminación cruzada durante la caracterización de un aminoácido requirió 4-5 pasos de lavado entre cada gota de muestra para que la intensidad de la contaminación cayera por debajo del límite de detección. [ 114 ]

Espectrómetros de masas en miniatura

Los espectrómetros de masas convencionales suelen ser grandes, prohibitivamente caros y complejos en su funcionamiento, lo que ha llevado al creciente atractivo de los espectrómetros de masas en miniatura (MMS) para diversas aplicaciones. Los MMS están optimizados para ser asequibles y de fácil manejo, a menudo prescindiendo de la necesidad de técnicos experimentados, con un bajo coste de fabricación y un tamaño lo suficientemente pequeño como para permitir la transferencia de la recopilación de datos del laboratorio al campo. [ 118 ] Estas ventajas suelen conllevar una reducción del rendimiento, ya que la resolución de los MMS, así como los límites de detección y cuantificación, a menudo son apenas suficientes para realizar tareas especializadas. La integración de DMF con MMS tiene el potencial de mejorar significativamente los sistemas MMS al aumentar el rendimiento, la resolución y la automatización, a la vez que se reduce el coste de los disolventes, lo que permite realizar análisis de grado de laboratorio a un coste mucho menor. En un ejemplo, el uso de un sistema DMF personalizado para análisis de drogas en orina permitió la creación de un instrumento que pesa solo 25  kg con un rendimiento comparable al de los análisis de laboratorio estándar. [ 119 ]

espectroscopia de resonancia magnética nuclear

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) puede utilizarse junto con la microfluídica digital (MFD) mediante el uso de microbobinas de RMN, que son bobinas conductoras electromagnéticas de menos de 1  mm de tamaño. Debido a su tamaño, estas microbobinas presentan varias limitaciones que influyen directamente en la sensibilidad de la maquinaria en la que operan.

Las interfaces de microcanales/microbobinas, anteriores a la microfluídica digital, presentaban varios inconvenientes, como la generación de grandes cantidades de residuos de disolvente y su fácil contaminación. [ 120 ] [ 121 ] En este sentido, el uso de la microfluídica digital y su capacidad para manipular gotas individuales resulta prometedor.

La interfaz entre la microfluídica digital y la relajometría por RMN ha dado lugar a la creación de sistemas como los utilizados para detectar y cuantificar las concentraciones de moléculas específicas a microescala [ 121 ] , algunos de los cuales emplean procesos de dos pasos en los que los dispositivos DMF guían las gotas al sitio de detección por RMN. [ 122 ] También se han desarrollado sistemas introductorios de RMN de alto campo y RMN 2D en combinación con la microfluídica. [ 120 ] Estos sistemas utilizan dispositivos DMF de una sola placa con microbobinas de RMN en lugar de la segunda placa. Recientemente, una versión modificada de esta interfaz incluyó unidades de gradientes de campo pulsados ​​(PFG) que permitieron a esta plataforma realizar mediciones de RMN más sofisticadas (por ejemplo, difusometría por RMN, mediciones de pulsos codificados por gradientes). [ 123 ] Este sistema se ha aplicado con éxito al monitoreo de reacciones orgánicas rápidas. [ 124 ]

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