dioxigenasa

Las dioxigenasas son enzimas oxidorreductasas . La vida aeróbica , desde bacterias unicelulares simples hasta organismos eucariotas complejos , ha evolucionado para depender del poder oxidante del dioxígeno en diversas vías metabólicas. Desde la generación de adenosín trifosfato (ATP) energético hasta la degradación de xenobióticos , el uso del dioxígeno como oxidante biológico está muy extendido y varía en su mecanismo exacto. Las enzimas emplean muchos esquemas diferentes para utilizar el dioxígeno, y esto depende en gran medida del sustrato y la reacción en cuestión.

En las monooxigenasas , solo un átomo de dioxígeno se incorpora a un sustrato, mientras que el otro se reduce a una molécula de agua. Las dioxigenasas ( EC 1.13.11 ) catalizan la oxidación de un sustrato sin la reducción de un átomo de oxígeno del dioxígeno a una molécula de agua. Sin embargo, esta definición es ambigua porque no tiene en cuenta cuántos sustratos intervienen en la reacción. La mayoría de las dioxigenasas incorporan completamente el dioxígeno a un solo sustrato, y se utilizan diversos esquemas de cofactores para lograrlo. Por ejemplo, en las enzimas dependientes de α-cetoglutarato , un átomo de dioxígeno se incorpora a dos sustratos, uno de los cuales siempre es α-cetoglutarato, y esta reacción es catalizada por un centro de hierro mononuclear.

El cofactor más comúnmente observado en las reacciones de dioxigenación es el hierro , pero el mecanismo catalítico empleado por estas enzimas que contienen hierro es muy diverso. Las dioxigenasas que contienen hierro se pueden subdividir en tres clases según cómo se incorpora el hierro al sitio activo: aquellas que emplean un centro de hierro mononuclear, aquellas que contienen un clúster de Rieske [2Fe-2S] y aquellas que utilizan un grupo prostético hemo .

dioxigenasas de hierro mononucleares

Las dioxigenasas de hierro mononucleares, o dioxigenasas dependientes de hierro no hemo , como también se las denomina, utilizan un único átomo de hierro catalítico para incorporar uno o ambos átomos de dioxígeno a un sustrato. A pesar de este evento común de oxigenación, las dioxigenasas de hierro mononucleares presentan diversidad en la forma en que se utiliza la activación del dioxígeno para promover ciertas reacciones químicas. ^{[ 1 ]} Por ejemplo, la ruptura del enlace carbono-carbono, la hidroperoxidación de ácidos grasos, la ruptura del enlace carbono-azufre y la oxidación de tioles son reacciones catalizadas por dioxigenasas de hierro mononucleares. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}

La mayoría de las dioxigenasas de hierro mononucleares pertenecen a la superfamilia cupina, cuya estructura de dominio general se describe como un pliegue de barril β de seis hebras (o motivo de rollo de gelatina ). En el centro de esta estructura de barril se encuentra un ion metálico, generalmente hierro ferroso, cuyo entorno de coordinación suele estar proporcionado por residuos en dos motivos estructurales parcialmente conservados: G(X) ₅ HXH(X) ₃ - ₄ E(X) ₆ G y G(X) ₅ - ₇ PXG(X) ₂ H(X) ₃ N. ^{[ 4 ] [ 5 ]}

Figura 1. Ruptura del anillo extradiol

Figura 2. Ruptura del anillo intradiol

Dos grupos importantes de dioxigenasas de hierro mononucleares no hemo son las dioxigenasas de catecol y las dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato (2OG) . ^{[ 6 ]} Las dioxigenasas de catecol , algunas de las enzimas dioxigenasas mejor estudiadas, utilizan dioxígeno para romper un enlace carbono-carbono de un sistema de anillo de catecol aromático . ^{[ 4 ]} Las dioxigenasas de catecol se clasifican además como "extradiol" o "intradiol", y esta distinción se basa en diferencias mecanísticas en las reacciones (figuras 1 y 2). Las enzimas intradiol rompen el enlace carbono-carbono entre los dos grupos hidroxilo. El centro férrico activo está coordinado por cuatro ligandos proteicos —dos residuos de histidina y dos de tirosinato— de manera bipiramidal trigonal con una molécula de agua ocupando el quinto sitio de coordinación. ^{[ 3 ]} Una vez que un sustrato catecolato se une al centro metálico de forma bidentada a través de los grupos hidroxilo desprotonados, el hierro férrico "activa" el sustrato mediante la abstracción de un electrón para producir un radical en el sustrato. Esto permite que se produzca la reacción con dioxígeno y la posterior escisión intradiol a través de un intermedio anhídrido cíclico. ^{[ 2 ] [ 4 ]} Los miembros extradiol utilizan hierro ferroso como estado redox activo, y este centro suele estar coordinado octaédricamente a través de un motivo 2-His-1-Glu con ligandos de agua lábiles que ocupan posiciones vacías. Una vez que un sustrato se une al centro ferroso, esto promueve la unión del dioxígeno y la posterior activación. ^{[ 2 ] [ 4 ] [ 7 ]} Esta especie de oxígeno activada procede entonces a reaccionar con el sustrato, escindiendo finalmente el enlace carbono-carbono adyacente a los grupos hidroxilo a través de la formación de un intermedio α-ceto lactona. ^{[ 3 ]}

En las dioxigenasas dependientes de 2OG, el hierro ferroso ( Fe(II) ) también está coordinado por un motivo de "triada facial" (His)2(Glu/Asp)1. La coordinación bidentada de 2OG y agua completa una esfera de coordinación pseudo-octaédrica. Tras la unión del sustrato, el ligando de agua se libera, produciendo un sitio de coordinación abierto para la activación del oxígeno. ^{[ 6 ]} Tras la unión del oxígeno, ocurre una transformación poco comprendida durante la cual el 2OG se descarboxila oxidativamente a succinato y el enlace OO se rompe para formar un intermedio Fe(IV)-oxo ( ferril ). Este potente oxidante se utiliza luego para llevar a cabo varias reacciones, incluyendo hidroxilación, halogenación y desmetilación. ^{[ 8 ]} En el caso mejor caracterizado, las hidroxilasas, el intermedio ferrilo abstrae un átomo de hidrógeno de la posición objetivo del sustrato, produciendo un radical de sustrato y Fe(III)-OH. Este radical se acopla entonces al ligando hidróxido, produciendo el producto hidroxilado y el estado de reposo Fe(II) de la enzima. ^{[ 8 ]}

dioxigenasas de Rieske

Las dioxigenasas de Rieske suelen catalizar la cis-dihidroxilación de arenos a productos cis-dihidro-diol. Estas dioxigenasas también catalizan la sulfoxidación, la desaturación y la oxidación bencílica. ^{[ 2 ]} Estas enzimas se encuentran prominentemente en bacterias del suelo como Pseudomonas , ^{[ 3 ]} y sus reacciones constituyen el paso inicial en la biodegradación de hidrocarburos aromáticos. ^{[ 2 ]} Las dioxigenasas de Rieske son estructuralmente más complejas que otras dioxigenasas debido a la necesidad de una vía de transferencia de electrones eficiente (figura 2) para mediar la reducción adicional y simultánea de dos electrones del sustrato aromático.

Las dioxigenasas de Rieske tienen tres componentes: una FAD reductasa dependiente de NADH , una ferredoxina con dos clústeres de Rieske [2Fe-2S] y una oxigenasa α3β3 con cada subunidad α que contiene un centro de hierro mononuclear y un clúster de Rieske [2Fe-2S]. ^{[ 2 ]} Dentro de cada subunidad α, el clúster de hierro-azufre y el centro de hierro mononuclear están separados por una distancia de ~43 Å, demasiado lejos para una transferencia de electrones eficiente . En cambio, se propone que la transferencia de electrones está mediada a través de estos dos centros en subunidades adyacentes, de modo que el clúster de hierro-azufre de una subunidad transfiere electrones al centro de hierro mononuclear de la subunidad adyacente que está convenientemente separado por ~12 Å. Si bien esta distancia parecería óptima para una transferencia de electrones eficiente, la sustitución del residuo de aspartato puente provoca una pérdida de la función enzimática, lo que sugiere que la transferencia de electrones se produce a través de la red de enlaces de hidrógeno mantenida por este residuo de aspartato. ^{[ 3 ]}

Se ha descrito el mecanismo de activación del O₂ _{por esta clase de dioxigenasas.} ^{[ 7 ]} Esta especie podría representar el oxidante activo, o podría sufrir una ruptura hemolítica del enlace OO para producir un intermedio hierro(V)-oxo como agente oxidante activo. ^{[ 3 ] [ 7 ]}

dioxigenasas que contienen hemo

Mientras que la mayoría de las dioxigenasas dependientes de hierro utilizan un cofactor de hierro no hemo, la oxidación de L-(y D-)triptófano a N-formilquinurenina es catalizada por la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) o la indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), que son dioxigenasas hemo que utilizan hierro coordinado por un grupo prostético hemo B. ^{[ 9 ] [ 10 ]} Si bien estas dioxigenasas son de interés en parte porque utilizan hemo de forma única para la catálisis, también lo son debido a su importancia en la regulación del triptófano en la célula, lo que tiene numerosas implicaciones fisiológicas. ^{[ 11 ]} Se cree que la asociación inicial del sustrato con el hierro-dioxígeno en el sitio activo de la enzima procede a través de una adición radicalaria o electrofílica, requiriendo hierro ferroso o hierro férrico, respectivamente. ^{[ 9 ]} Si bien el mecanismo de reacción exacto para las dioxigenasas dependientes del hemo aún está en debate, se postula que la reacción procede a través de un mecanismo de dioxetano o de Criegee (figuras 4, 5). ^{[ 9 ] [ 11 ]}

Figura 4. Posible mecanismo de reordenamiento de Criegee por TDO/IDO

Figura 5. Posible mecanismo de dioxetano por TDO/IDO

Aunque el hierro es, con mucho, el cofactor más frecuente utilizado para la dioxigenación enzimática, no es necesario para todas las dioxigenasas para la catálisis. La quercetina 2,3-dioxigenasa (quercetinasa, QueD) cataliza la escisión dioxigenólítica de la quercetina en ácido 2-protocatecuoilfloroglucinolcarboxílico y monóxido de carbono . ^{[ 12 ]} La enzima mejor caracterizada, de Aspergillus japonicus , requiere la presencia de cobre , ^{[ 4 ]} y se han descubierto quercetinasas bacterianas que son bastante promiscuas (cambialistas) ^{[ 13 ]} en sus requerimientos de un centro metálico, con diferentes grados de actividad reportados con la sustitución de manganeso , cobalto , hierro, níquel y cobre divalentes . ^{[ 12 ]} (Quercetina, función en el metabolismo). La acireductona (1,2-dihidroxi-5-(metiltio)pent-1-en-3-ona) dioxigenasa (ARD) se encuentra tanto en procariotas como en eucariotas . ^{[ 4 ] [ 12 ] [ 14 ]} Las enzimas ARD de la mayoría de las especies se unen al hierro ferroso y catalizan la oxidación de la acireductona a 4-(metiltio)-2-oxobutanoato, el α-cetoácido de la metionina y ácido fórmico . Sin embargo, la ARD de Klebsiella oxytoca cataliza una reacción adicional cuando se une el níquel(II): en su lugar produce 3-(metiltio)propionato, formato y monóxido de carbono a partir de la reacción de la acireductona con dioxígeno. La actividad de Fe-ARD está estrechamente ligada a la vía de recuperación de metionina, en la que el producto metiltioadenosina de las reacciones celulares de S-adenosilmetionina (SAM) se convierte finalmente en acireductona.

Aunque no se conoce el papel exacto de Ni-ARD, se sospecha que ayuda a regular los niveles de metionina actuando como un derivador en la vía de recuperación. Esta enzima de K. oxytoca representa un ejemplo único en el que el ion metálico presente determina qué reacción se cataliza. Las quercetinasas y las enzimas ARD son miembros de la superfamilia cupina , a la que también pertenecen las enzimas de hierro mononucleares. ^{[ 15 ]} El esquema de coordinación del metal para las enzimas QueD es 3-His o 3-His-1-Glu, siendo la disposición exacta específica del organismo. ^{[ 4 ]} Todas las enzimas ARD quelan el metal catalítico (ya sea Ni o Fe) a través del motivo 3-His-1-Glu. ^{[ 15 ]} En estas dioxigenasas, los ligandos de coordinación son proporcionados por ambos motivos cupina típicos. En las enzimas ARD, el metal existe en una disposición octaédrica con los tres residuos de histidina que comprenden una tríada facial. ^{[ 14 ]} Los centros metálicos de la quercetinasa bacteriana suelen tener un entorno de coordinación bipiramidal trigonal u octaédrico cuando hay cuatro ligandos proteicos; los centros metálicos de las enzimas QueD dependientes de cobre poseen una geometría tetraédrica distorsionada en la que solo los tres residuos de histidina conservados proporcionan ligandos de coordinación. ^{[ 4 ] [ 12 ]} Los sitios de coordinación vacíos en todos los centros metálicos están ocupados por ligandos de agua hasta que estos son desplazados por el sustrato entrante.

La capacidad de estas dioxigenasas para mantener su actividad en presencia de otros cofactores metálicos con amplios rangos de potenciales redox sugiere que el centro metálico no participa activamente en la activación del dioxígeno. Más bien, se cree que el centro metálico funciona para mantener el sustrato en la geometría adecuada para que reaccione con el dioxígeno. En este sentido, estas enzimas recuerdan a las dioxigenasas de catecol intradiol , en las que los centros metálicos activan el sustrato para su posterior reacción con el dioxígeno.

Las dioxigenasas que catalizan reacciones sin necesidad de un cofactor son mucho más raras en la naturaleza que las que sí los requieren. Se ha demostrado que dos dioxigenasas, la 1H-3-hidroxi-4-oxoquinolina 2,4-dioxigenasa (QDO) y la 1H-3-hidroxi-4-oxoquinaldina 2,4-dioxigenasa (HDO), no requieren ni un cofactor orgánico ni metálico. ^{[ 16 ]} Estas enzimas catalizan la degradación de heterociclos de quinolona de manera similar a la quercetina dioxigenasa , pero se cree que median una reacción radicalaria de una molécula de dioxígeno con un carbanión en el sustrato (figura 5). ^{[ 17 ]} Tanto HDO como QDO pertenecen a la superfamilia de enzimas α/β hidrolasas , aunque los residuos catalíticos en HDO y QDO no parecen cumplir la misma función que en el resto de las enzimas de la superfamilia α/β hidrolasa. ^{[ 16 ]}

La diversidad en la familia de las dioxigenasas implica una amplia gama de funciones biológicas:

• La triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO) ayuda a regular el triptófano en el organismo y se expresa en muchos tumores humanos. ^{[ 18 ]} La otra dioxigenasa dependiente del hierro hemo, la IDO, también es relevante para la salud humana, ya que interviene en las respuestas inflamatorias en el contexto de ciertas enfermedades. ^{[ 19 ]} La IDO afecta tanto al triptófano como a la quinurenina y se ha relacionado con la depresión en humanos. ^{[ 20 ]}
• La alcaptonuria es una enfermedad genética que produce una deficiencia de homogentisato 1,2-dioxigenasa , enzima responsable de catalizar la formación de 4-maleilacetoacetato a partir de homogentisato . ^{[ 21 ]} La acumulación de ácido homogentísico puede provocar daños en las válvulas cardíacas, cálculos renales y daños en el cartílago del cuerpo. ^{[ 22 ]}
• La neurodegeneración asociada a la pantotenato quinasa (PKAN) es un trastorno autosómico recesivo que puede provocar la formación de gránulos de hierro y cuerpos de Lewy en las neuronas . Un estudio ha demostrado que los pacientes diagnosticados con PKAN presentaban niveles elevados de cisteína en el globo pálido como consecuencia de una deficiencia de cisteína dioxigenasa . ^{[ 23 ]} Los pacientes con PKAN suelen desarrollar síntomas de demencia y a menudo fallecen a una edad temprana en la edad adulta.
• En la reparación del ADN, la dioxigenasa AlkB , dependiente de Fe (II)/2-oxoglutarato , interviene en la eliminación oxidativa del daño por alquilación en el ADN. La imposibilidad de eliminar este daño puede provocar citotoxicidad o mutagénesis durante la replicación del ADN.
• Las ciclooxigenasas (COX), responsables de la formación de prostanoides en el cuerpo humano, son el objetivo de muchos analgésicos AINE . ^{[ 10 ]} La inhibición de la COX reduce la inflamación y tiene un efecto analgésico debido a la disminución de la síntesis de prostaglandinas y tromboxanos.