Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Bioinformática de citometría de flujo

La bioinformática de citometría de flujo es la aplicación de la bioinformática a los datos de citometría de flujo , lo que implica almacenar, recuperar, organizar y analizar dic...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita
Este artículo se publicó en la revista científica revisada por pares PLOS Computational Biology (2013). Haga clic para ver la versión publicada.

La bioinformática de citometría de flujo es la aplicación de la bioinformática a los datos de citometría de flujo , lo que implica almacenar, recuperar, organizar y analizar dichos datos utilizando amplios recursos y herramientas computacionales. La bioinformática de citometría de flujo requiere un uso extensivo de la estadística computacional y el aprendizaje automático , y contribuye a su desarrollo . La citometría de flujo y los métodos relacionados permiten cuantificar múltiples biomarcadores independientes en un gran número de células individuales . El rápido crecimiento en la multidimensionalidad y el rendimiento de los datos de citometría de flujo, especialmente en la década de 2000, ha propiciado la creación de diversos métodos de análisis computacional, estándares de datos y bases de datos públicas para compartir los resultados.

Existen métodos computacionales para facilitar el preprocesamiento de datos de citometría de flujo, la identificación de poblaciones celulares, la comparación de dichas poblaciones entre muestras y el diagnóstico y descubrimiento a partir de los resultados de los pasos previos. El preprocesamiento incluye la compensación de la superposición espectral, la transformación de datos a escalas que faciliten su visualización y análisis, la evaluación de la calidad de los datos y su normalización entre muestras y experimentos. Para la identificación de poblaciones, existen herramientas que permiten la identificación manual tradicional en diagramas de dispersión bidimensionales (detección de poblaciones), la reducción de dimensionalidad para optimizar la detección de poblaciones y la identificación automática de poblaciones en espacios de mayor dimensión mediante diversos métodos. También es posible caracterizar los datos de forma más exhaustiva, mediante técnicas como la partición binaria del espacio guiada por densidad , conocida como binning probabilístico, o mediante la detección combinatoria de poblaciones. Finalmente, el diagnóstico mediante datos de citometría de flujo puede mejorarse con técnicas de aprendizaje supervisado , y el descubrimiento de nuevos tipos celulares de importancia biológica mediante métodos estadísticos de alto rendimiento, como parte de flujos de trabajo que integran todos los métodos mencionados.

Los estándares abiertos , los datos y el software también son partes clave de la bioinformática de la citometría de flujo. Los estándares de datos incluyen el ampliamente adoptado Estándar de Citometría de Flujo (FCS), que define cómo deben almacenarse los datos de los citómetros, pero también varios estándares nuevos en desarrollo por la Sociedad Internacional para el Avance de la Citometría (ISAC) para ayudar a almacenar información más detallada sobre el diseño experimental y los pasos analíticos. Los datos abiertos están creciendo lentamente con la apertura de la base de datos CytoBank en 2010 y FlowRepository en 2012, las cuales permiten a los usuarios distribuir libremente sus datos, y esta última ha sido recomendada por ISAC como el repositorio preferido para datos compatibles con MIFlowCyt. El software abierto está más ampliamente disponible en forma de un conjunto de paquetes Bioconductor , pero también está disponible para su ejecución web en la plataforma GenePattern .

Recopilación de datos

Diagrama esquemático de un citómetro de flujo, que muestra el enfoque de la vaina de fluido, el láser, la óptica (en forma simplificada, omitiendo el enfoque), los tubos fotomultiplicadores (PMT), el convertidor analógico-digital y la estación de trabajo de análisis.

Los citómetros de flujo funcionan enfocando hidrodinámicamente las células en suspensión para que se separen entre sí dentro de una corriente de fluido. Esta corriente es analizada por uno o más láseres, y la luz fluorescente y dispersa resultante es detectada por fotomultiplicadores . Mediante filtros ópticos , se pueden cuantificar fluoróforos específicos presentes en las células o en su interior, a partir de los picos en sus espectros de emisión . Estos pueden ser fluoróforos endógenos, como la clorofila o la proteína verde fluorescente transgénica , o fluoróforos artificiales unidos covalentemente a moléculas de detección, como anticuerpos para detectar proteínas o sondas de hibridación para detectar ADN o ARN .

La capacidad de cuantificar estos parámetros ha propiciado que la citometría de flujo se utilice en una amplia gama de aplicaciones, entre las que se incluyen, entre otras:

Hasta principios de la década de 2000, la citometría de flujo solo podía medir unos pocos marcadores fluorescentes a la vez. Sin embargo, desde finales de la década de 1990 hasta mediados de la década de 2000, el rápido desarrollo de nuevos fluoróforos dio como resultado instrumentos modernos capaces de cuantificar hasta 18 marcadores por célula. [ 7 ] Más recientemente, la nueva tecnología de citometría de masas reemplaza los fluoróforos con elementos de tierras raras detectados por espectrometría de masas de tiempo de vuelo , logrando la capacidad de medir la expresión de 34 o más marcadores. [ 8 ] Al mismo tiempo, los métodos de qPCR microfluídica están proporcionando un método similar a la citometría de flujo para cuantificar 48 o más moléculas de ARN por célula. [ 9 ] El rápido aumento en la dimensionalidad de los datos de citometría de flujo, junto con el desarrollo de plataformas robóticas de alto rendimiento capaces de analizar cientos o miles de muestras automáticamente, ha creado la necesidad de mejorar los métodos de análisis computacional. [ 7 ]

Datos

Representación de datos de citometría de flujo de un instrumento con tres canales de dispersión y 13 canales de fluorescencia. Solo se muestran los valores de las primeras 30 células (de cientos de miles).

Los datos de citometría de flujo se presentan como una gran matriz de intensidades en un rango de M longitudes de onda, con N eventos. La mayoría de los eventos corresponden a una célula específica, aunque algunos pueden ser dobletes (pares de células que pasan cerca del láser). Para cada evento, se registra la intensidad de fluorescencia medida en un rango de longitud de onda determinado.

La intensidad de fluorescencia medida indica la cantidad de ese fluoróforo en la célula, lo que a su vez indica la cantidad que se ha unido a moléculas detectoras como los anticuerpos. Por lo tanto, la intensidad de fluorescencia puede considerarse un indicador de la cantidad de moléculas detectoras presentes en la célula. Una forma simplificada, aunque no del todo precisa, de considerar los datos de citometría de flujo es como una matriz de M mediciones por N células, donde cada elemento corresponde a la cantidad de moléculas.

Pasos en el análisis de datos de citometría de flujo computacional

Un ejemplo de flujo de trabajo para el análisis de datos de citometría de flujo y algunos de los paquetes de Bioconductor relevantes para cada paso.

El proceso de pasar de los datos primarios de citometría de flujo al diagnóstico de enfermedades y al descubrimiento de biomarcadores implica cuatro pasos principales:

  1. Preprocesamiento de datos (incluyendo compensación, transformación y normalización)
  2. Identificación de poblaciones celulares (también conocida como selección de poblaciones celulares)
  3. Coincidencia de poblaciones celulares para la comparación entre muestras
  4. Relación entre poblaciones celulares y variables externas (diagnóstico y descubrimiento)

Algunos programas de citometría de flujo permiten guardar los pasos realizados en un flujo de trabajo específico, lo cual es importante para la reproducibilidad de los experimentos. Sin embargo, los archivos de espacio de trabajo guardados rara vez son intercambiables entre programas. [ 10 ] Un intento por solucionar este problema es el desarrollo del estándar de datos basado en XML Gating-ML (que se analiza con más detalle en la sección de estándares), el cual se está adoptando gradualmente tanto en software de citometría de flujo comercial como de código abierto. [ 11 ] El paquete CytoML de R también está cubriendo esta necesidad al importar/exportar Gating-ML, que es compatible con los programas FlowJo , CytoBank y FACS Diva.

preprocesamiento de datos

Antes del análisis, los datos de citometría de flujo generalmente deben someterse a un preprocesamiento para eliminar artefactos y datos de baja calidad, y para transformarlos a una escala óptima que permita identificar las poblaciones celulares de interés. A continuación, se describen los distintos pasos de un proceso típico de preprocesamiento de datos de citometría de flujo.

Compensación

Cuando se utiliza más de un fluorocromo con el mismo láser, sus espectros de emisión suelen superponerse. Cada fluorocromo se mide normalmente con un filtro óptico de paso de banda ajustado a una banda estrecha en o cerca del pico de intensidad de emisión del fluorocromo. Como resultado, la lectura de cualquier fluorocromo es en realidad la suma de la intensidad de emisión máxima de ese fluorocromo y la intensidad de los espectros de todos los demás fluorocromos en la zona donde se superponen con esa banda de frecuencia. Esta superposición se denomina solapamiento espectral, y el proceso para eliminarlo de los datos de citometría de flujo se denomina compensación. [ 12 ]

La compensación se suele realizar analizando una serie de muestras representativas, cada una teñida con un solo fluorocromo, para obtener mediciones de la contribución de cada fluorocromo a cada canal. [ 12 ] La señal total que se debe eliminar de cada canal se puede calcular resolviendo un sistema de ecuaciones lineales basado en estos datos para producir una matriz de solapamiento, que al invertirse y multiplicarse por los datos brutos del citómetro produce los datos compensados. [ 12 ] [ 13 ] Los procesos de cálculo de la matriz de solapamiento, o la aplicación de una matriz de solapamiento precalculada para compensar los datos de citometría de flujo, son características estándar del software de citometría de flujo. [ 14 ]

Transformación

Las poblaciones celulares detectadas mediante citometría de flujo suelen describirse como de expresión aproximadamente log-normal . [ 15 ] Por ello, tradicionalmente se han transformado a una escala logarítmica . En los primeros citómetros, esto se realizaba incluso antes de la adquisición de datos mediante un amplificador logarítmico . En los instrumentos modernos, los datos se almacenan generalmente en formato lineal y se transforman digitalmente antes del análisis.

Sin embargo, los datos de citometría de flujo compensados ​​frecuentemente contienen valores negativos debido a la compensación, y se presentan poblaciones celulares con medias bajas y distribuciones normales. [ 16 ] Las transformaciones logarítmicas no pueden manejar adecuadamente los valores negativos y muestran de forma deficiente los tipos celulares con distribución normal. [ 16 ] [ 17 ] Las transformaciones alternativas que abordan este problema incluyen las transformaciones híbridas log-lineales Logicle [ 16 ] [ 18 ] e Hyperlog, [ 19 ] así como el arcoseno hiperbólico y Box-Cox . [ 20 ]

Una comparación de transformaciones de uso común concluyó que las transformaciones biexponenciales y de Box-Cox, cuando se parametrizaban de forma óptima, proporcionaban la visualización más clara y la menor varianza de las poblaciones celulares entre muestras. [ 17 ] Sin embargo, una comparación posterior del paquete flowTrans utilizado en dicha comparación indicó que no parametrizaba la transformación Logicle de manera consistente con otras implementaciones, lo que podría poner en duda esos resultados. [ 21 ]

Control de calidad

Particularmente en experimentos más recientes y de alto rendimiento, se necesitan métodos de visualización para ayudar a detectar errores técnicos en muestras individuales. Un enfoque es visualizar estadísticas descriptivas , como las funciones de distribución empíricas de dimensiones únicas de réplicas técnicas o biológicas para asegurar que sean similares. [ 22 ] Para mayor rigor, se puede utilizar la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar si las muestras individuales se desvían de la norma. [ 22 ] La prueba de Grubbs para valores atípicos puede utilizarse para detectar muestras que se desvían del grupo.

Un método para el control de calidad en espacios de dimensiones superiores consiste en utilizar la agrupación probabilística con intervalos que se ajustan al conjunto de datos completo. [ 23 ] La desviación estándar del número de celdas que caen en los intervalos dentro de cada muestra puede tomarse como una medida de similitud multidimensional, donde las muestras más cercanas a la norma tienen una desviación estándar menor. [ 23 ] Con este método, una desviación estándar más alta puede indicar valores atípicos, aunque se trata de una medida relativa, ya que el valor absoluto depende en parte del número de intervalos.

Con todos estos métodos, se mide la variación entre muestras. Sin embargo, lo que se busca medir es la combinación de las variaciones técnicas introducidas por los instrumentos y su manipulación, junto con la información biológica real. Distinguir entre las contribuciones técnicas y biológicas a la variación entre muestras puede ser una tarea difícil, incluso imposible. [ 24 ]

Normalización

Particularmente en estudios multicéntricos, la variación técnica puede dificultar la comparación de poblaciones de células biológicamente equivalentes entre muestras. Por lo tanto , los métodos de normalización para eliminar la varianza técnica, frecuentemente derivados de técnicas de registro de imágenes , son un paso crítico en muchos análisis de citometría de flujo. La normalización de un solo marcador se puede realizar mediante el registro de puntos de referencia, en el que se identifican los picos en una estimación de densidad de kernel de cada muestra y se alinean entre muestras. [ 24 ]

Identificación de poblaciones celulares

Diagramas de dispersión bidimensionales que abarcan las tres combinaciones de tres dimensiones seleccionadas. Los colores muestran la comparación del consenso de ocho compuertas manuales independientes (polígonos) y compuertas automatizadas (puntos de color). El consenso de las compuertas manuales y los algoritmos se generó utilizando el paquete CLUE. [ 25 ] Figura reproducida de. [ 26 ]

La complejidad de los datos brutos de citometría de flujo (decenas de mediciones para miles o millones de células) dificulta responder preguntas directamente mediante pruebas estadísticas o aprendizaje supervisado. Por lo tanto, un paso fundamental en el análisis de datos de citometría de flujo es reducir esta complejidad a algo más manejable, estableciendo al mismo tiempo características comunes entre las muestras. Esto generalmente implica identificar regiones multidimensionales que contienen grupos de células funcional y fenotípicamente homogéneos. [ 27 ] Esta es una forma de análisis de clúster . Existen diversos métodos para lograrlo, los cuales se detallan a continuación.

Compuertas

Los datos generados por los citómetros de flujo se pueden representar en una o dos dimensiones para producir un histograma o un diagrama de dispersión. Las regiones en estos gráficos se pueden separar secuencialmente, según la intensidad de fluorescencia , mediante la creación de una serie de extracciones de subconjuntos, denominadas " puertas ". Estas puertas se pueden producir utilizando software, por ejemplo, FlowJo , [ 28 ] FCS Express, [ 29 ] WinMDI, [ 30 ] CytoPaint (también conocido como Paint-A-Gate), [ 31 ] VenturiOne, Cellcion , CellQuest Pro, Cytospec, [ 32 ] Kaluza, [ 33 ] o flowCore.

En conjuntos de datos con un número bajo de dimensiones y variabilidad técnica y biológica limitada entre muestras (p. ej., laboratorios clínicos), el análisis manual de poblaciones celulares específicas puede producir resultados efectivos y reproducibles. Sin embargo, el análisis exploratorio de un gran número de poblaciones celulares en un conjunto de datos de alta dimensión no es factible. [ 34 ] Además, el análisis manual en entornos menos controlados (p. ej., estudios entre laboratorios) puede aumentar la tasa de error general del estudio. [ 35 ] En un estudio, varios algoritmos de compuertas computacionales tuvieron un mejor desempeño que el análisis manual en presencia de cierta variación. [ 26 ] Sin embargo, a pesar de los avances considerables en el análisis computacional, la compuerta manual sigue siendo la principal solución para la identificación de poblaciones celulares raras específicas que no están bien separadas de otros tipos de células.

Selección guiada por reducción de dimensionalidad

El número de diagramas de dispersión que deben investigarse aumenta con el cuadrado del número de marcadores medidos (o más rápido, ya que algunos marcadores deben investigarse varias veces para cada grupo de células para resolver diferencias de alta dimensión entre tipos de células que parecen ser similares en la mayoría de los marcadores). [ 36 ] Para abordar este problema, se ha utilizado el análisis de componentes principales para resumir los conjuntos de datos de alta dimensión utilizando una combinación de marcadores que maximiza la varianza de todos los puntos de datos. [ 37 ] Sin embargo, el PCA es un método lineal y no puede preservar relaciones complejas y no lineales. Más recientemente, se han utilizado diseños de árboles de expansión mínima bidimensionales para guiar el proceso de compuertas manual. Se utilizó el submuestreo y la agrupación basados ​​en la densidad para representar mejor las poblaciones raras y controlar la complejidad de tiempo y memoria del proceso de construcción del árbol de expansión mínima. [ 38 ] Aún quedan por investigar algoritmos de reducción de dimensión más sofisticados . [ 39 ]

Poblaciones celulares en un conjunto de datos de citometría de masas de alta dimensión, seleccionadas manualmente después de la reducción de dimensionalidad mediante un diseño 2D para un árbol de expansión mínima. Figura reproducida a partir de los datos proporcionados en [ 40 ] .

Compuertas automatizadas

El desarrollo de herramientas computacionales para la identificación de poblaciones celulares ha sido un área de investigación activa desde 2008. Recientemente se han desarrollado muchos enfoques de agrupamiento individuales, incluidos algoritmos basados ​​en modelos (por ejemplo, flowClust [ 41 ] y FLAME [ 42 ] ), algoritmos basados ​​en densidad (por ejemplo, FLOCK [ 43 ] y SWIFT), enfoques basados ​​en grafos (por ejemplo, SamSPECTRAL [ 44 ] ) y, más recientemente, híbridos de varios enfoques (flowMeans [ 45 ] y flowPeaks [ 46 ] ). Estos algoritmos difieren en términos de memoria y complejidad temporal, sus requisitos de software, su capacidad para determinar automáticamente el número requerido de poblaciones celulares y su sensibilidad y especificidad . El proyecto FlowCAP (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods), con la participación activa de la mayoría de los grupos académicos con esfuerzos de investigación en el área, está proporcionando una forma de comparar objetivamente los enfoques de análisis automatizados de última generación. [ 26 ] Otros estudios también han comparado métodos automatizados. herramientas de selección en varios conjuntos de datos. [ 47 ] [ 48 ] [ 49 ] [ 50 ]

Métodos de agrupamiento de probabilidad

Ejemplo de selección por diferencia de frecuencia, creada con el paquete flowFP de Bioconductor. Los puntos representan eventos individuales en un archivo FCS. Los rectángulos representan los intervalos.

La discretización probabilística es un método de análisis sin compuertas en el que los datos de citometría de flujo se dividen en cuantiles de forma univariada. [ 51 ] Las ubicaciones de los cuantiles se pueden utilizar para probar las diferencias entre muestras (en las variables que no se dividen) mediante la prueba de chi-cuadrado. [ 51 ]

Posteriormente, esto se extendió a múltiples dimensiones mediante la técnica de selección por diferencia de frecuencia, una técnica de partición binaria del espacio donde los datos se dividen iterativamente a lo largo de la mediana. [ 52 ] Estas particiones (o intervalos) se ajustan a una muestra de control. Luego, la proporción de células que caen dentro de cada intervalo en las muestras de prueba se puede comparar con la muestra de control mediante la prueba de chi cuadrado.

Finalmente, la huella dactilar citométrica utiliza una variante de la técnica de selección por diferencia de frecuencia para establecer intervalos y medir, en una serie de muestras, cuántas células caen dentro de cada intervalo. [ 23 ] Estos intervalos pueden utilizarse como compuertas y emplearse para análisis posteriores de forma similar a los métodos de selección automatizados.

Compuertas combinatorias

Los algoritmos de agrupamiento de alta dimensionalidad a menudo no logran identificar tipos celulares poco frecuentes que no se distinguen claramente de otras poblaciones principales. La identificación de estas pequeñas poblaciones celulares en múltiples muestras resulta aún más compleja. En el análisis manual, el conocimiento biológico previo (por ejemplo, controles biológicos) proporciona orientación para identificar razonablemente estas poblaciones. Sin embargo, la integración de esta información en el proceso de agrupamiento exploratorio (por ejemplo, en el aprendizaje semisupervisado ) no ha tenido éxito.

Una alternativa a la agrupación de alta dimensión consiste en identificar poblaciones celulares utilizando un marcador a la vez y luego combinarlas para producir grupos de mayor dimensión. Esta funcionalidad se implementó por primera vez en FlowJo. [ 28 ] El algoritmo flowType se basa en este marco al permitir la exclusión de los marcadores. [ 53 ] Esto posibilita el desarrollo de herramientas estadísticas (por ejemplo, RchyOptimyx) que pueden investigar la importancia de cada marcador y excluir redundancias de alta dimensión. [ 54 ]

Diagnóstico y descubrimiento

Descripción general del flujo de trabajo flowType/RchyOptimyx para la identificación de correlatos de protección contra el VIH: Primero, se identifican decenas de miles de poblaciones celulares mediante la combinación de particiones unidimensionales (panel uno). A continuación, las poblaciones celulares se analizan mediante una prueba estadística (y el método de Bonferroni para la corrección de pruebas múltiples) para identificar aquellas correlacionadas con la información de supervivencia. El tercer panel muestra una jerarquía de compuertas completa que describe todas las estrategias posibles para compuertas para esa población celular. Este gráfico se puede analizar para identificar la "mejor" estrategia de compuertas (es decir, aquella en la que los marcadores más importantes aparecen antes). Estas jerarquías para todos los fenotipos seleccionados se muestran en el panel 4. En el panel 5, estas jerarquías se fusionan en un único gráfico que resume todo el conjunto de datos y demuestra la compensación entre el número de marcadores involucrados en cada fenotipo y la significancia de la correlación con el resultado clínico (por ejemplo, como se mide mediante el estimador de Kaplan-Meier en el panel 6). Figura reproducida en parte de [ 53 ] y. [ 54 ]

Tras la identificación de la población celular de interés, se puede realizar un análisis entre muestras para identificar variaciones fenotípicas o funcionales que se correlacionen con una variable externa (por ejemplo, un resultado clínico). Estos estudios se pueden dividir en dos grupos principales:

Diagnóstico

En estos estudios, el objetivo suele ser diagnosticar una enfermedad (o una subclase de enfermedad) utilizando variaciones en una o más poblaciones celulares. Por ejemplo, se puede utilizar la agrupación multidimensional para identificar un conjunto de grupos, compararlos en todas las muestras y, posteriormente, utilizar el aprendizaje supervisado para construir un clasificador que prediga las clases de interés (por ejemplo, este enfoque puede utilizarse para mejorar la precisión de la clasificación de subtipos específicos de linfoma [ 55 ] ). Alternativamente, todas las células de la cohorte completa pueden agruparse en un único espacio multidimensional para su agrupación antes de la clasificación. [ 56 ] Este enfoque es particularmente adecuado para conjuntos de datos con una gran cantidad de variación biológica (en los que la comparación entre muestras es compleja), pero requiere que las variaciones técnicas se controlen cuidadosamente. [ 57 ]

Descubrimiento

En un contexto de descubrimiento, el objetivo es identificar y describir poblaciones celulares correlacionadas con una variable externa (a diferencia del contexto de diagnóstico, donde el objetivo es combinar el poder predictivo de múltiples tipos celulares para maximizar la precisión de los resultados). De manera similar al caso de uso de diagnóstico, la coincidencia de clústeres en un espacio de alta dimensión puede utilizarse para el análisis exploratorio, pero el poder descriptivo de este enfoque es muy limitado, ya que es difícil caracterizar y visualizar una población celular en un espacio de alta dimensión sin antes reducir la dimensionalidad. [ 56 ] [ 58 ] Finalmente, los enfoques de compuerta combinatoria han tenido un éxito particular en el análisis exploratorio de datos de FCM. Simplified Presentation of Incredibly Complex Evaluations (SPICE) es un paquete de software que puede utilizar la funcionalidad de compuerta de FlowJo para evaluar estadísticamente una amplia gama de diferentes poblaciones celulares y visualizar aquellas que están correlacionadas con el resultado externo. flowType y RchyOptimyx (como se mencionó anteriormente) amplían esta técnica al agregar la capacidad de explorar el impacto de marcadores independientes en la correlación general con el resultado externo. Esto permite eliminar marcadores innecesarios y proporciona una visualización sencilla de todos los tipos de células identificados. En un análisis reciente de una gran cohorte (n=466) de pacientes VIH+, este proceso identificó tres correlatos de protección contra el VIH, de los cuales solo uno había sido identificado previamente mediante un análisis manual exhaustivo del mismo conjunto de datos. [ 53 ]

Formatos de datos e intercambio

Estándar de citometría de flujo

El estándar de citometría de flujo (FCS) se desarrolló en 1984 para permitir el registro y el intercambio de datos de citometría de flujo. [ 59 ] Desde entonces, FCS se convirtió en el formato de archivo estándar compatible con todos los proveedores de software y hardware de citometría de flujo. La especificación FCS ha sido tradicionalmente desarrollada y mantenida por la Sociedad Internacional para el Avance de la Citometría (ISAC). [ 60 ] A lo largo de los años, se incorporaron actualizaciones para adaptarse a los avances tecnológicos tanto en citometría de flujo como en tecnologías informáticas con FCS 2.0 introducido en 1990, [ 61 ] FCS 3.0 en 1997, [ 62 ] y la especificación más reciente FCS 3.1 en 2010. [ 63 ] FCS solía ser el único formato de archivo ampliamente adoptado en citometría de flujo. Recientemente, ISAC ha desarrollado formatos de archivo estándar adicionales.

netCDF

ISAC está considerando reemplazar FCS con una versión específica para citometría de flujo del formato de archivo Network Common Data Form (netCDF). [ 64 ] netCDF es un conjunto de bibliotecas de software de libre acceso y formatos de datos independientes de la máquina que permiten la creación, el acceso y el intercambio de datos científicos orientados a matrices. En 2008, ISAC redactó la primera versión de las convenciones netCDF para el almacenamiento de datos brutos de citometría de flujo. [ 65 ]

Estándar de Citometría de Archivo (ACS)

El Estándar de Citometría de Archivo (ACS) se está desarrollando para agrupar datos con diferentes componentes que describen experimentos de citometría. [ 66 ] Captura las relaciones entre datos, metadatos, archivos de análisis y otros componentes, e incluye soporte para registros de auditoría, control de versiones y firmas digitales. El contenedor ACS se basa en el formato de archivo ZIP con una tabla de contenido basada en XML que especifica las relaciones entre los archivos del contenedor. Se ha adoptado la Recomendación de Firma XML del W3C para permitir firmas digitales de los componentes dentro del contenedor ACS. Un borrador inicial de ACS se diseñó en 2007 y se finalizó en 2010. Desde entonces, se ha introducido soporte para ACS en varias herramientas de software, incluidas FlowJo y Cytobank.

Gating-ML

La falta de interoperabilidad de las compuertas ha sido tradicionalmente un cuello de botella que impide la reproducibilidad del análisis de datos de citometría de flujo y el uso de múltiples herramientas analíticas. Para abordar esta deficiencia, ISAC desarrolló Gating-ML, un mecanismo basado en XML para describir formalmente las compuertas y las transformaciones de datos (escala) relacionadas. [ 10 ] La versión preliminar de recomendación de Gating-ML fue aprobada por ISAC en 2008 y es parcialmente compatible con herramientas como FlowJo, flowUtils, las bibliotecas CytoML en R/BioConductor y FlowRepository. [ 66 ] Admite compuertas rectangulares, compuertas poligonales, politopos convexos, elipsoides, árboles de decisión y colecciones booleanas de cualquier otro tipo de compuerta. Además, incluye docenas de transformaciones públicas integradas que han demostrado ser potencialmente útiles para la visualización o el análisis de datos de citometría. En 2013, la versión 2.0 de Gating-ML fue aprobada por el Grupo de Trabajo de Estándares de Datos de ISAC como Recomendación. Esta nueva versión ofrece una flexibilidad ligeramente menor en términos de la potencia de la descripción de compuertas; sin embargo, también es significativamente más fácil de implementar en herramientas de software. [ 11 ]

Resultados de la clasificación (CLR)

El formato de archivo de resultados de clasificación (CLR) [ 67 ] se ha desarrollado para intercambiar los resultados de los enfoques de clasificación manual y algorítmica de forma estandarizada, con el fin de poder informar y procesar la clasificación. CLR se basa en el formato de archivo CSV, comúnmente utilizado , con columnas que corresponden a diferentes clases y valores de celda que contienen la probabilidad de que un evento pertenezca a una clase particular. Estos se capturan como valores entre 0 y 1. La simplicidad del formato y su compatibilidad con las herramientas de hoja de cálculo comunes han sido los principales requisitos que impulsaron el diseño de la especificación. Aunque se diseñó originalmente para el campo de la citometría de flujo, es aplicable en cualquier dominio que necesite capturar clasificaciones, ya sean difusas o inequívocas, de prácticamente cualquier tipo de objeto.

Datos y software públicos

Al igual que en otros campos de la bioinformática, el desarrollo de nuevos métodos ha adoptado principalmente la forma de software libre de código abierto , y se han creado varias bases de datos para depositar datos abiertos .

Puerta automática

AutoGate [ 68 ] realiza compensación, selección de clústeres, previsualización de clústeres, búsqueda exhaustiva de proyección (EPP), escalado multidimensional y fenograma, y ​​produce un dendrograma visual para indicar la preparación para HiD. Es gratuito para investigadores y clínicos de instituciones académicas, gubernamentales y sin fines de lucro.

Bioconductor

El proyecto Bioconductor es un repositorio de software libre de código abierto, escrito principalmente en el lenguaje de programación R. [ 69 ] En julio de 2013, Bioconductor contenía 21 paquetes de software para el procesamiento de datos de citometría de flujo. [ 70 ] Estos paquetes cubren la mayor parte de la gama de funcionalidades descritas anteriormente en este artículo.

Patrón genético

GenePattern es una plataforma de análisis principalmente genómico con más de 200 herramientas para el análisis de la expresión génica, la proteómica y otros datos. Su interfaz web facilita el acceso a estas herramientas y permite la creación de flujos de análisis automatizados, lo que posibilita la investigación reproducible. Recientemente, se ha desarrollado GenePattern Flow Cytometry Suite para poner a disposición de los investigadores sin conocimientos de programación herramientas avanzadas de análisis de datos de citometría de flujo. Contiene cerca de 40 módulos de código abierto de GenePattern para citometría de flujo, que abarcan desde el procesamiento básico de archivos estándar de citometría de flujo (FCS) hasta algoritmos avanzados para la identificación automatizada de poblaciones celulares, la normalización y la evaluación de la calidad. Internamente, la mayoría de estos módulos aprovechan la funcionalidad desarrollada en BioConductor.

Gran parte de la funcionalidad de los paquetes Bioconductor para el análisis de citometría de flujo se ha empaquetado para su uso con el sistema de flujo de trabajo GenePattern [ 71 ] , en forma de GenePattern Flow Cytometry Suite. [ 72 ]

FACSanadu

FACSanadu [ 73 ] es una aplicación portátil de código abierto para la visualización y el análisis de datos FCS. A diferencia de Bioconductor, es un programa interactivo dirigido a usuarios sin conocimientos de programación para análisis rutinarios. Admite archivos FCS estándar, así como datos de perfil COPAS.

hema.to

hema.to es un servicio web para la clasificación de datos de citometría de flujo de pacientes con sospecha de linfoma. [ 74 ] La inteligencia artificial de la herramienta utiliza una red neuronal convolucional profunda para reconocer patrones de subtipos distintos. Todos los datos y el código son de acceso abierto. [ 75 ] Procesa datos brutos, lo que hace innecesario el filtrado. Para un rendimiento óptimo con datos nuevos, se requiere un ajuste fino mediante transferencia de conocimiento. [ 76 ]

Bases de datos públicas

La Información Mínima sobre un Experimento de Citometría de Flujo (MIFlowCyt) exige que cualquier dato de citometría de flujo utilizado en una publicación esté disponible, aunque no incluye la obligación de depositarlo en una base de datos pública. [ 77 ] Por lo tanto, si bien las revistas Cytometry Part A y B, así como todas las revistas del Nature Publishing Group, exigen el cumplimiento de MIFlowCyt, todavía existe relativamente poca información de citometría de flujo disponible públicamente. Sin embargo, se han realizado algunos esfuerzos para crear bases de datos públicas.

En primer lugar, CytoBank, que es una plataforma web completa para el almacenamiento y análisis de datos de citometría de flujo, se ha puesto a disposición del público de forma limitada. [ 78 ] Utilizando el código base de CytoBank, se desarrolló FlowRepository en 2012 con el apoyo de ISAC para ser un repositorio público de datos de citometría de flujo. [ 79 ] FlowRepository facilita el cumplimiento de MIFlowCyt, [ 80 ] y a julio de 2013 contenía 65 conjuntos de datos públicos. [ 81 ]

conjuntos de datos

En 2012, la comunidad de citometría de flujo comenzó a publicar un conjunto de conjuntos de datos disponibles públicamente. Un subconjunto de estos conjuntos de datos que representa los desafíos existentes en el análisis de datos se describe a continuación. Para comparar con la selección manual, el proyecto FlowCAP-I publicó cinco conjuntos de datos, seleccionados manualmente por analistas humanos, y dos de ellos seleccionados por ocho analistas independientes. [ 26 ] El proyecto FlowCAP-II incluyó tres conjuntos de datos para clasificación binaria y también informó sobre varios algoritmos que pudieron clasificar estas muestras perfectamente. FlowCAP-III incluyó dos conjuntos de datos más grandes para comparar con las selecciones manuales, así como un conjunto de datos de clasificación de muestras más desafiante. A marzo de 2013, la publicación pública de FlowCAP-III aún estaba en curso. [ 82 ] Los conjuntos de datos utilizados en FlowCAP-I, II y III tienen un número bajo de sujetos o parámetros. Sin embargo, recientemente se han publicado varios conjuntos de datos clínicos más complejos, incluido un conjunto de datos de 466 sujetos infectados por el VIH, que proporciona ensayos de 14 parámetros e información clínica suficiente para el análisis de supervivencia. [ 54 ] [ 83 ] [ 84 ] [ 85 ]

Otro tipo de conjuntos de datos son los ensayos de citometría de masas de alta dimensión. Un ejemplo representativo es un estudio que analiza dos muestras de médula ósea utilizando más de 30 marcadores de superficie o intracelulares bajo una amplia gama de estímulos diferentes. [ 8 ] Los datos brutos de este conjunto de datos están disponibles públicamente, tal como se describe en el manuscrito, y los análisis manuales de los marcadores de superficie se pueden solicitar a los autores.

Problemas abiertos

A pesar del rápido desarrollo en el campo de la bioinformática de la citometría de flujo, aún quedan varios problemas por resolver.

La variabilidad en los experimentos de citometría de flujo se debe a la variación biológica entre las muestras, las variaciones técnicas entre los instrumentos utilizados y los métodos de análisis. En 2010, un grupo de investigadores de la Universidad de Stanford y los Institutos Nacionales de Salud señalaron que, si bien la variación técnica puede mitigarse estandarizando el manejo de las muestras, la configuración de los instrumentos y la selección de reactivos, resolver la variación en los métodos de análisis requerirá una estandarización similar y la automatización computacional de los métodos de selección de poblaciones celulares. [ 86 ] Además, opinaron que la centralización tanto de los datos como del análisis podría ayudar a disminuir la variabilidad entre experimentos y a comparar los resultados. [ 86 ]

Esto fue corroborado por otro grupo de investigadores de Pacific Biosciences y la Universidad de Stanford, quienes sugirieron que la computación en la nube podría permitir el análisis centralizado, estandarizado y de alto rendimiento de experimentos de citometría de flujo. [ 87 ] También enfatizaron que el desarrollo y la adopción continuos de formatos de datos estándar podrían seguir ayudando a reducir la variabilidad entre experimentos. [ 87 ] Asimismo, propusieron que se necesitarán nuevos métodos para modelar y resumir los resultados del análisis de alto rendimiento de manera que puedan ser interpretados por los biólogos, [ 87 ] así como formas de integrar datos de citometría de flujo a gran escala con otra información biológica de alto rendimiento, como la expresión génica , la variación genética , los niveles de metabolitos y los estados de enfermedad. [ 87 ]

Véase también

Referencias

Este artículo fue adaptado de la siguiente fuente bajo una licencia CC BY 4.0 ( 2013 ) ( informes de revisión ): Kieran O'Neill; Nima Aghaeepour; Josef Spidlen; Ryan Brinkman (5 de diciembre de 2013). " Flow cytometry bioinformatics" . PLOS Computational Biology . 9 (12) e1003365. doi : 10.1371/JOURNAL.PCBI.1003365 . ISSN 1553-734X . PMC 3867282. PMID 24363631. Wikidata Q21045422 .    

  1. ↑ Brando, B.; Barnett, D.; Janossy, G.; Mandy, F.; Autran, B.; Rothe, G.; Scarpati, B.; d'Avanzo, G.; d'Hautcourt, JL; Lenkei, R.; Schmitz, G.; Kunkl, A.; Chianese, R.; Papa, S.; Gratama, JW (2000). "Métodos citofluorométricos para evaluar el número absoluto de subconjuntos celulares en sangre" . Cytometry . 42 (6): 327– 346. doi : 10.1002/1097-0320(20001215)42:6 < 327::AID-CYTO1000 > 3.0.CO ; 2-F . PMID 11135287 . S2CID 13492197 .  
  2. ^ Ferreira-Facio, CS; Milito, C.; Botafogo, V.; Fontana, M.; Thiago, LS; Oliveira, E.; Da Rocha-Filho, AS; Werneck, F.; Forny, DN; Dekermacher, S.; De Azambuja, AP; Ferman, SE; De Faria, PANS; Tierra, pop; Orfão, A.; Costa, ES (2013). Aziz, Syed A (ed.). "Contribución del inmunofenotipo de citometría de flujo multiparamétrica al cribado diagnóstico y clasificación del cáncer pediátrico" . MÁS UNO . 8 (3) e55534. Código Bib : 2013PLoSO...855534F . doi : 10.1371/journal.pone.0055534 . PMC 3589426 . PMID 23472067 .  
  3. ↑ Wu, D.; Wood, BL; Fromm, JR (2013). "Citometría de flujo para linfoma no Hodgkin y linfoma de Hodgkin clásico". Lymphoma . Methods in Molecular Biology. Vol. 971. pp. 27–47 . doi : 10.1007/978-1-62703-269-8_2 . ISBN   978-1-62703-268-1. PMID 23296956 . 
  4. ↑ Wang, Y.; Hammes, F.; De Roy, K.; Verstraete, W.; Boon, N. (2010). "Aplicaciones pasadas, presentes y futuras de la citometría de flujo en microbiología acuática" . Trends in Biotechnology . 28 (8): 416– 424. doi : 10.1016/j.tibtech.2010.04.006 . PMID 20541271 . 
  5. ↑ Johnson, LA; Flook, JP; Look, MV; Pinkel, D. (1987). "Clasificación por citometría de flujo de espermatozoides portadores de cromosomas X e Y en dos poblaciones". Gamete Research . 16 (1): 1– 9. doi : 10.1002/mrd.1120160102 . PMID 3506896 . 
  6. ↑ Baerlocher, GM; Vulto, I.; De Jong, G.; Lansdorp, PM (2006). "Citometría de flujo y FISH para medir la longitud promedio de los telómeros (flow FISH)". Nature Protocols . 1 (5): 2365– 2376. doi : 10.1038/nprot.2006.263 . PMID 17406480 . S2CID 20463557 .  
  7. 1 2 Chattopadhyay, PK; Hogerkorp, CM; Roederer, M. (2008). "Una explosión cromática: el desarrollo y el futuro de la citometría de flujo multiparamétrica" . Immunology . 125 ( 4): 441– 449. doi : 10.1111/j.1365-2567.2008.02989.x . PMC 2612557. PMID 19137647 .  
  8. 1 2 Behbehani, GK; Bendall, SC; Clutter, MR; Fantl, WJ; Nolan, GP (2012). " Citometría de masas de célula única adaptada a mediciones del ciclo celular" . Cytometry Part A. 81A ( 7): 552– 566. doi : 10.1002/cyto.a.22075 . PMC 3667754. PMID 22693166 .  
  9. ↑ White, AK; Vaninsberghe, M.; Petriv, OI; Hamidi, M.; Sikorski, D.; Marra, MA; Piret, J.; Aparicio, S.; Hansen, CL (2011). "RT-qPCR de célula única microfluídica de alto rendimiento" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 108 (34): 13999– 14004. Bibcode : 2011PNAS..10813999W . doi : 10.1073/pnas.1019446108 . PMC 3161570. PMID 21808033 .  
  10. 1 2 Spidlen, J.; Leif, RC; Moore, W.; Roederer, M.; Brinkman, RR; Brinkman, RR (2008). "Gating-ML: descripciones de compuertas basadas en XML en citometría de flujo" . Cytometry Part A. 73A ( 12): 1151– 1157. doi : 10.1002/cyto.a.20637 . PMC 2585156. PMID 18773465 .  
  11. 1 2 Gating-ML 2.0 (PDF) (Informe). Sociedad Internacional para el Avance de la Citometría. 2013.
  12. 1 2 3 Roederer, M. (2002). J. Paul Robinson (ed.). Compensación en citometría de flujo . Current Protocols in Cytometry. Vol. 22. pp. 1.14.1–1.14.20. doi : 10.1002/0471142956.cy0114s22 . ISBN   978-0-471-14295-9. PMID 18770762 . S2CID 7256386 .  
  13. ↑ Bagwell, CB; Adams, EG (1993). "Compensación de la superposición espectral de fluorescencia para cualquier número de parámetros de citometría de flujo". Anales de la Academia de Ciencias de Nueva York . 677 (1): 167– 184. Bibcode : 1993NYASA.677..167B . doi : 10.1111/j.1749-6632.1993.tb38775.x . PMID 8494206. S2CID 26763280 .  
  14. ↑ Hahne, F.; Lemeur, N.; Brinkman, RR; Ellis, B.; Haaland, P.; Sarkar, D.; Spidlen, J.; Strain, E.; Gentleman, R. (2009). "FlowCore: Un paquete de Bioconductor para citometría de flujo de alto rendimiento" . BMC Bioinformatics . 10 (1) 106. Bibcode : 2009BMCBi..10..106H . doi : 10.1186/1471-2105-10-106 . PMC 2684747. PMID 19358741 .  
  15. ↑ Shapiro, Howard M. (2003). Citometría de flujo práctica . Nueva York: Wiley-Liss. pág. 235. ISBN  978-0-471-41125-3.
  16. 1 2 3 Parks DR, Roederer M, Moore WA (2006). "Un nuevo método de visualización "Logicle" evita los efectos engañosos del escalado logarítmico para señales bajas y datos compensados". Cytometry Part A . 69 (6): 541– 51. doi : 10.1002/cyto.a.20258 . PMID 16604519 . S2CID 8012792 .  
  17. 1 2 Finak, G.; Perez, JM; Weng, A.; Gottardo, R. (2010). "Optimizing transformations for automated, high throughput analysis of flow cytometry data" . BMC Bioinformatics . 11 546. doi : 10.1186/1471-2105-11-546 . PMC 3243046. PMID 21050468 .  
  18. ↑ Moore, WA; Parks, DR (2012). " Actualización para la escala de datos logicle que incluye implementaciones de código operativo" . Cytometry Part A. 81A ( 4): 273– 277. doi : 10.1002/cyto.a.22030 . PMC 4761345. PMID 22411901 .  
  19. ↑ Bagwell, CB (2005). "Hyperlog? Una transformación flexible tipo logaritmo para datos con valores negativos, cero y positivos" . Cytometry Part A. 64A ( 1): 34– 42. doi : 10.1002/cyto.a.20114 . PMID 15700280. S2CID 13705174 .  
  20. ↑ Lo, K.; Brinkman, RR; Gottardo, R. (2008). "Automated gating of flow cytometry data via robust model-based clustering" . Cytometry Part A. 73A ( 4): 321– 332. doi : 10.1002/cyto.a.20531 . PMID 18307272. S2CID 2943705 .  
  21. ↑ Qian, Y.; Liu, Y.; Campbell, J.; Thomson, E.; Kong, YM; Scheuermann, RH (2012). "FCSTrans: Un sistema de software de código abierto para la conversión de archivos FCS y la transformación de datos" . Cytometry Part A. 81A ( 5): 353– 356. doi : 10.1002/cyto.a.22037 . PMC 3932304. PMID 22431383 .  
  22. 1 2 Le Meur, N.; Rossini, A.; Gasparetto, M.; Smith, C.; Brinkman, RR; Gentleman, R. (2007). "Evaluación de la calidad de los datos de citometría de flujo sin compuerta en experimentos de alto rendimiento" . Cytometry Part A. 71A ( 6): 393– 403. doi : 10.1002/cyto.a.20396 . PMC 2768034. PMID 17366638 .  
  23. 1 2 3 Rogers, WT; Moser, AR; Holyst, HA; Bantly, A.; Mohler, ER; Scangas, G.; Moore, JS (2008). " Huellas dactilares citométricas: Caracterización cuantitativa de distribuciones multivariadas" . Cytometry Part A. 73A ( 5): 430– 441. doi : 10.1002/cyto.a.20545 . PMID 18383310. S2CID 23555926 .  
  24. 1 2 Hahne, F.; Khodabakhshi, AH; Bashashati, A.; Wong, CJ; Gascoyne, RD; Weng, AP; Seyfert-Margolis, V.; Bourcier, K.; Asare, A.; Lumley, T.; Gentleman, R.; Brinkman, RR (2009). " Métodos de normalización de base por canal para datos de citometría de flujo" . Cytometry Part A. 77 ( 2): 121– 131. doi : 10.1002/cyto.a.20823 . PMC 3648208. PMID 19899135 .  
  25. ↑ "Paquete CLUE" . Consultado el 15 de febrero de 2013 .
  26. 1 2 3 4 Aghaeepour, N.; Finak, G.; Tapa de flujo, D.; Sueño, AH; Hoos, P.; Mosmann, G.; Brinkman, J.; Gotardo, I.; Scheuermann, SA; Bramson, J.; Aleros, C.; Weng, AP; III, FSE; Ho, K.; Kollmann, T.; Rogers, W.; De Rosa, S.; Dalal, B.; Azad, A.; Poten, A.; Brandes, A.; Bretschneider, H.; Bruggner, R.; Finck, R.; Jia, R.; Zimmerman, N.; Linderman, M.; Eneldo, D.; Nolan, G.; Chan, C. (2013). "Evaluación crítica de técnicas automatizadas de análisis de datos de citometría de flujo" . Métodos de la naturaleza . 10 (3): 228– 238. doi : 10.1038/nmeth.2365 . PMC 3906045 . PMID 23396282 .  
  27. ↑ Lugli, E.; Roederer, M.; Cossarizza, A. (2010). "Análisis de datos en citometría de flujo: El futuro acaba de empezar" . Cytometry Part A. 77A ( 7): 705– 713. doi : 10.1002/cyto.a.20901 . PMC 2909632. PMID 20583274 .  
  28. 1 2 "FlowJo" . Archivado del original el 3 de mayo de 2013. Recuperado el 5 de abril de 2013 .
  29. ↑ "FCS Express" . Consultado el 3 de abril de 2013 .
  30. ↑ "Página del software de citometría de TSRI" . Archivado del original el 19 de noviembre de 1996. Consultado el 3 de septiembre de 2009 .
  31. ↑ "CytoPaint Classic" . Archivado del original el 29/12/2017 . Consultado el 05/04/2013 .
  32. ↑ "Página del software de citometría de PUCL" . Consultado el 7 de julio de 2011 .
  33. ↑ "Beckman Coulter" . Consultado el 10 de febrero de 2013 .
  34. ↑ Bendall, SC; Nolan, GP (2012). "De células individuales a fenotipos profundos en el cáncer". Nature Biotechnology . 30 (7): 639– 647. doi : 10.1038/nbt.2283 . PMID 22781693 . S2CID 163651 .  
  35. ^ Maecker, HT; Rinfret, A.; d'Souza, P.; Darden, J.; Roig, E.; Landry, C.; Hayes, P.; Birungi, J.; Anzala, O.; García, M.; Harari, A.; Frank, yo; Baydo, R.; panadero, M.; Holbrook, J.; Ottinger, J.; Lamoreaux, L.; Epling, CL; Sinclair, E.; Suni, MA; Punt, K.; Calarota, S.; El-Bahi, S.; Alterar, G.; Maila, H.; Kuta, E.; Cox, J.; Gris, C.; Altfeld, M.; Nougaréde, N. (2005). "Estandarización de ensayos de citometría de flujo de citoquinas" . Inmunología BMC . 6 13. doi : 10.1186/1471-2172-6-13 . PMC 1184077 . PMID 15978127 .  
  36. ↑ Virgo, PF; Gibbs, GJ (2011). "Citometría de flujo en patología clínica" . Annals of Clinical Biochemistry . 49 (Pt 1): 17–28 . doi : 10.1258/acb.2011.011128 . PMID 22028426 . 
  37. ↑ Costa, ES; Pedreira, CE; Barrena, S.; Lecrevisse, Q.; Flores, J.; Quijano, S.; Almeida, J.; Del Carmen García-Macias, M.; Bottcher, S.; Van Dongen, JJM; Orfao, A. (2010). "Análisis de componentes principales guiado por patrones automatizado frente a clasificación inmunofenotípica basada en expertos de trastornos linfoproliferativos crónicos de células B: un paso adelante en la estandarización del inmunofenotipado clínico" . Leukemia . 24 ( 11): 1927– 1933. doi : 10.1038/leu.2010.160 . PMC 3035971. PMID 20844562 .  
  38. ↑ Qiu, P.; Simonds, EF; Bendall, SC; Gibbs Jr, KD; Bruggner, RV; Linderman, MD; Sachs, K.; Nolan, GP; Plevritis, SK (2011). "Extracción de una jerarquía celular a partir de datos de citometría de alta dimensión con SPADE" . Nature Biotechnology . 29 (10): 886– 891. doi : 10.1038/nbt.1991 . PMC 3196363. PMID 21964415 .  
  39. ↑ "Caja de herramientas de Matlab para la reducción de dimensionalidad" . Archivado del original el 18 de diciembre de 2012. Consultado el 10 de febrero de 2013 .
  40. ↑ Bendall, SC; Simonds, EF; Qiu, P.; Amir, E. -AD; Krutzik, PO; Finck, R.; Bruggner, RV; Melamed, R.; Trejo, A.; Ornatsky, OI; Balderas, RS; Plevritis, SK; Sachs, K.; Pe'Er, D.; Tanner, SD; Nolan, GP (2011). "Citometría de masas de células individuales de respuestas inmunes y farmacológicas diferenciales a lo largo de un continuo hematopoyético humano" . Science . 332 ( 6030): 687– 696. Bibcode : 2011Sci...332..687B . doi : 10.1126/science.1198704 . PMC 3273988. PMID 21551058 .  
  41. ↑ Lo, K.; Hahne, F.; Brinkman, RR; Gottardo, R. (2009). "FlowClust: Un paquete de Bioconductor para la selección automatizada de datos de citometría de flujo" . BMC Bioinformatics . 10 145. doi : 10.1186/1471-2105-10-145 . PMC 2701419. PMID 19442304 .  
  42. ↑ Pyne, S.; Hu, X.; Wang, K.; Rossin, E.; Lin, T. -I.; Maier, LM; Baecher-Allan, C.; McLachlan, GJ; Tamayo, P.; Hafler, DA; De Jager, PL; Mesirov, JP (2009). "Análisis automatizado de datos de citometría de flujo de alta dimensión" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 106 (21): 8519– 8524. Bibcode : 2009PNAS..106.8519P . doi : 10.1073/pnas.0903028106 . PMC 2682540. PMID 19443687 .  
  43. ↑ Qian, Y.; Wei, C.; Eun-Hyung Lee, F.; Campbell, J.; Halliley, J.; Lee, JA; Cai, J.; Kong, YM; Sadat, E.; Thomson, E.; Dunn, P.; Seegmiller, AC; Karandikar, NJ; Tipton, CM; Mosmann, T.; Sanz, IA; Scheuermann, RH (2010). "Elucidación de diecisiete subconjuntos de células B de sangre periférica humana y cuantificación de la respuesta al tétanos utilizando un método basado en la densidad para la identificación automatizada de poblaciones celulares en datos de citometría de flujo multidimensional" . Cytometry Part B. 78B ( Supl. 1): S69– S82 . doi : 10.1002/cyto.b.20554 . PMC 3084630. PMID 20839340 .  
  44. ↑ Zare, H.; Shooshtari, P.; Gupta, A.; Brinkman, RR (2010). "Reducción de datos para agrupamiento espectral para analizar datos de citometría de flujo de alto rendimiento" . BMC Bioinformatics . 11 403. doi : 10.1186/1471-2105-11-403 . PMC 2923634. PMID 20667133 .  
  45. ↑ Aghaeepour, N.; Nikolic, R.; Hoos, HH; Brinkman, RR (2011). "Identificación rápida de poblaciones celulares en datos de citometría de flujo" . Cytometry Part A. 79A ( 1): 6– 13. doi : 10.1002/cyto.a.21007 . PMC 3137288. PMID 21182178 .  
  46. ↑ Ge, Y.; Sealfon, SC (2012). "FlowPeaks: A fast unsupervised clustering for flow cytometry data via K-means and density peak finding" . Bioinformatics . 28 ( 15): 2052–2058 . doi : 10.1093/bioinformatics/bts300 . PMC 3400953. PMID 22595209 .  
  47. ↑ Weber, Lukas; Robinson, Mark (2016). "Comparación de métodos de agrupamiento para datos de citometría de flujo y de masas de células individuales de alta dimensión". Cytometry Part A . 89 (12): 1084– 1096. bioRxiv 10.1101/047613 . doi : 10.1002/cyto.a.23030 . 
  48. ↑ Chester, C (2015). "Herramientas algorítmicas para la minería de datos de citometría de alta dimensión" . Journal of Immunology . 195 (3): 773– 779. doi : 10.4049/jimmunol.1500633 . PMC 4507289. PMID 26188071 .  
  49. ↑ Diggins, KE (2015). " Métodos para el descubrimiento y la caracterización de subconjuntos celulares en datos de citometría de masas de alta dimensión" . Methods . 82 : 55–63 . doi : 10.1016/j.ymeth.2015.05.008 . PMC 4468028. PMID 25979346 .  
  50. ↑ Wiwie, C (2015). "Comparación del rendimiento de los métodos de agrupamiento biomédico". Nature Methods . 12 (11): 1033– 1038. doi : 10.1038/nmeth.3583 . PMID 26389570 . S2CID 8960399 .  
  51. 1 2 Roederer, M.; Treister, A.; Moore, W.; Herzenberg, LA (2001). "Comparación de intervalos de probabilidad: una métrica para cuantificar las diferencias de distribución univariada" . Cytometry . 45 (1): 37– 46. doi : 10.1002/1097-0320(20010901)45:1 < 37::AID-CYTO1142 > 3.0.CO ; 2-E . PMID 11598945 . 
  52. ↑ Roederer, M.; Hardy, RR (2001). "Frequency difference gating: A multivariate method for identification subsets that differ between samples" . Cytometry . 45 (1): 56– 64. doi : 10.1002/1097-0320(20010901)45:1 < 56::AID-CYTO1144 > 3.0.CO ; 2-9 . PMID 11598947 . 
  53. 1 2 3 Aghaeepour, N.; Chattopadhyay, PK; Ganesan, A.; O'Neill, K.; Zare, H.; Jalali, A.; Hoos, HH; Roederer, M.; Brinkman, RR (2012). "Los correlatos inmunológicos tempranos de la protección contra el VIH pueden identificarse a partir del análisis computacional de ensayos complejos de citometría de flujo de células T multivariados" . Bioinformatics . 28 ( 7): 1009– 1016. doi : 10.1093/bioinformatics/bts082 . PMC 3315712. PMID 22383736 .  
  54. 1 2 3 Aghaeepour, N.; Jalali, A.; O'Neill, K.; Chattopadhyay, PK; Roederer, M.; Hoos, HH; Brinkman, RR (2012). "RchyOptimyx: Optimización de la jerarquía celular para citometría de flujo" . Cytometry Part A. 81A ( 12): 1022– 1030. doi : 10.1002/cyto.a.22209 . PMC 3726344. PMID 23044634 .  
  55. ↑ Zare, H.; Bashashati, A.; Kridel, R.; Aghaeepour, N.; Haffari, G.; Connors, JM; Gascoyne, RD; Gupta, A.; Brinkman, RR; Weng, AP (2011). "El análisis automatizado de datos de citometría de flujo multidimensional mejora la precisión diagnóstica entre el linfoma de células del manto y el linfoma linfocítico pequeño" . American Journal of Clinical Pathology . 137 (1): 75– 85. doi : 10.1309/AJCPMMLQ67YOMGEW . PMC 4090220. PMID 22180480 .  
  56. 1 2 Qiu, P. (2012). Ma'Ayan, Avi (ed.). "Inferencia de propiedades fenotípicas a partir de características de células individuales" . PLOS ONE . 7 (5) e37038. Bibcode : 2012PLoSO...737038Q . doi : 10.1371/journal.pone.0037038 . PMC 3360688. PMID 22662133 .  
  57. ↑ Bodenmiller, B.; Zunder, ER; Finck, R.; Chen, TJ; Savig, ES; Bruggner, RV; Simonds, EF; Bendall, SC; Sachs, K.; Krutzik, PO; Nolan, GP (2012). "Perfilado de estados celulares perturbados por reguladores de moléculas pequeñas mediante citometría de masas multiplexada" . Nature Biotechnology . 30 (9): 858– 867. doi : 10.1038/nbt.2317 . PMC 3627543. PMID 22902532 .  
  58. ↑ Bashashati, A.; Johnson, NA; Khodabakhshi, AH; Whiteside, MD; Zare, H.; Scott, DW; Lo, K.; Gottardo, R.; Brinkman, FSL; Connors, JM; Slack, GW; Gascoyne, RD; Weng, AP; Brinkman, RR (2012). "Las células B con alto parámetro de dispersión lateral por citometría de flujo se correlacionan con una supervivencia inferior en el linfoma difuso de células B grandes" . American Journal of Clinical Pathology . 137 (5): 805– 814. doi : 10.1309/AJCPGR8BG4JDVOWR . PMC 3718075. PMID 22523221 .  
  59. ↑ Murphy, RF; Chused, TM (1984). "Una propuesta para un estándar de archivo de datos de citometría de flujo" . Cytometry . 5 (5): 553– 555. doi : 10.1002/cyto.990050521 . PMID 6489069 . 
  60. ↑ "Sociedad Internacional para el Avance de la Citometría" . Consultado el 5 de marzo de 2013 .
  61. ↑ Dean, PN; Bagwell, CB; Lindmo, T.; Murphy, RF; Salzman, GC (1990). "Introducción al estándar de archivo de datos de citometría de flujo" . Cytometry . 11 (3): 321– 322. doi : 10.1002/cyto.990110302 . PMID 2340768 . 
  62. ↑ Seamer, LC; Bagwell, CB; Barden, L.; Redelman, D.; Salzman, GC; Wood, JCS; Murphy, RF (1997). "Propuesta de nuevo estándar de archivo de datos para citometría de flujo, versión FCS 3.0" . Cytometry . 28 (2): 118– 122. doi : 10.1002/(SICI)1097-0320(19970601)28:2 < 118::AID-CYTO3 > 3.0.CO ; 2-B . PMID 9181300 . 
  63. ↑ Spidlen, J.; Moore, W.; Parks, D.; Goldberg, M.; Bray, C.; Bierre, P.; Gorombey, P.; Hyun, B.; Hubbard, M.; Lange, S.; Lefebvre, R.; Leif, R.; Novo, D.; Ostruszka, L.; Treister, A.; Wood, J.; Murphy, RF; Roederer, M.; Sudar, D.; Zigon, R.; Brinkman, RR (2009). "Data File Standard for Flow Cytometry, version FCS 3.1" . Cytometry Part A. 77 ( 1): 97–100 . doi : 10.1002/ cyto.a.20825 . PMC 2892967. PMID 19937951 .  
  64. ↑ Leif, Robert C.; Spidlen, Josef; Brinkman, Ryan R. (2008). "Continuo de estándares de citometría" (PDF) . En Farkas, Daniel L; Nicolau, Dan V; Leif, Robert C (eds.). Actas de SPIE: Imagen, manipulación y análisis de biomoléculas, células y tejidos VI . Vol. 6859. pág. 17. Bibcode : 2008SPIE.6859E..17L . CiteSeerX 10.1.1.397.3647 . doi : 10.1117/12.762514 . S2CID 62650477 .    
  65. ↑ Sociedad Internacional para el Avance de la Citometría (2008). Convenciones estándar de NetCDF para citometría analítica para el componente de archivo de datos binarios en modo lista.
  66. 1 2 Spidlen, J.; Shooshtari, P.; Kollmann, TR; Brinkman, RR (2011). "Estándares de datos de citometría de flujo" . BMC Research Notes . 4 50. doi : 10.1186/1756-0500-4-50 . PMC 3060130. PMID 21385382 .  
  67. ↑ Formato de archivo de resultados de clasificación (PDF) (Informe). Sociedad Internacional para el Avance de la Citometría. 2012.
  68. ↑ "CytoGenie - Página principal del software AutoGate" . CytoGenie.org . Laboratorio Herzenberg de la Universidad de Stanford . Consultado el 14 de enero de 2020 .
  69. ↑ Gentleman, RC; Carey, VJ; Bates, DM; Bolstad, B.; Dettling, M.; Dudoit, S. ; Ellis, B.; Gautier, L.; Ge, Y.; Gentry, J.; Hornik, K.; Hothorn, T.; Huber, W.; Iacus, S.; Irizarry, R.; Leisch, F.; Li, C.; Maechler, M.; Rossini, AJ; Sawitzki, G.; Smith, C.; Smyth, G.; Tierney, L.; Yang, JY; Zhang, J. (2004). "Bioconductor: desarrollo de software abierto para biología computacional y bioinformática" . Genome Biology . 5 (10): R80. doi : 10.1186/gb-2004-5-10-r80 . PMC 545600 . PMID 15461798 .  
  70. ↑ Bioconductor. "Vista de citometría de flujo de BioConductor" . Consultado el 11 de julio de 2013 .
  71. ↑ Reich, M.; Liefeld, T.; Gould, J.; Lerner, J.; Tamayo, P.; Mesirov, JP (2006). "Patrón genético 2.0". Genética de la Naturaleza . 38 (5): 500– 501. doi : 10.1038/ng0506-500 . PMID 16642009 . S2CID 5503897 .  
  72. ↑ "GenePattern Flow Cytometry Suite" . Archivado del original el 29 de enero de 2013. Consultado el 14 de febrero de 2013 .
  73. ↑ "FACSanadu - Software de análisis FCS gratuito y fácil de usar" .
  74. ↑ Zhao, Max; Mallesh, Nanditha; Höllein, Alexander; Schabath, Richard; Haferlach, Claudia; Haferlach, Torsten; Elsner, Franz; Lüling, Hannes; Krawitz, Peter; Kern, Wolfgang (2020). "Clasificación a nivel de hematólogo de neoplasias de células B maduras mediante aprendizaje profundo en datos de citometría de flujo multiparamétrica" . Cytometry Part A. 97 ( 10): 1073– 1080. doi : 10.1002/cyto.a.24159 . ISSN 1552-4930 . PMID 32519455. S2CID 219563125 .   
  75. ↑ Zhao, Max Xiaohang; Mallesh, Nanditha (16 de junio de 2021), Datos de replicación para: Transferencia de conocimiento para mejorar el rendimiento de los modelos de aprendizaje profundo para la clasificación automatizada de neoplasias de células B , Harvard Dataverse, doi : 10.7910/DVN/CQHHEH
  76. ^ Mallesh, Nanditha; Zhao, Max; Meintker, Lisa; Hollein, Alexander; Elsner, Franz; Lüling, Hannes; Haferlach, Torsten; Kern, Wolfgang; Westermann, Jörg; Brossart, Pedro; Krause, Stefan W. (septiembre de 2021). "Transferencia de conocimientos para mejorar el rendimiento de modelos de aprendizaje profundo para la clasificación automatizada de neoplasias de células B" . Patrones . 2 (10) 100351. doi : 10.1016/j.patter.2021.100351 . ISSN 2666-3899 . PMC 8515009 . PMID 34693376 .   
  77. ↑ Lee, JA; Spidlen, J.; Boyce, K.; Cai, J.; Crosbie, N.; Dalphin, M.; Furlong, J.; Gasparetto, M.; Goldberg, M.; Goralczyk, EM; Hyun, B.; Jansen, K.; Kollmann, T.; Kong, M.; Leif, R.; McWeeney, S.; Moloshok, TD; Moore, W.; Nolan, G.; Nolan, J.; Nikolich-Zugich, J.; Parrish, D.; Purcell, B.; Qian, Y.; Selvaraj, B.; Smith, C.; Tchuvatkina, O.; Wertheimer, A.; Wilkinson, P.; Wilson, C. (2008). "MIFlowCyt: La información mínima sobre un experimento de citometría de flujo" . Cytometry Part A. 73A (10): 926– 930. doi : 10.1002/cyto.a.20623 . PMC 2773297 . PMID 18752282 .  
  78. ↑ Kotecha, N.; Krutzik, PO; Irish, JM (2010). J. Paul Robinson (ed.). Análisis y publicación en línea de experimentos de citometría de flujo . Current Protocols in Cytometry. Vol. Capítulo 10. pp. 10.17.1–10.17.24. doi : 10.1002/0471142956.cy1017s53 . ISBN   978-0-471-14295-9. PMC 4208272 . PMID 20578106 .  
  79. ↑ Spidlen, J.; Breuer, K.; Rosenberg, C.; Kotecha, N.; Brinkman, RR (2012). "FlowRepository: Un recurso de conjuntos de datos de citometría de flujo anotados asociados con publicaciones revisadas por pares" . Cytometry Part A. 81A ( 9): 727– 731. doi : 10.1002/cyto.a.22106 . PMID 22887982. S2CID 6498066 .  
  80. ↑ Spidlen, J.; Breuer, K.; Brinkman, R. (2012). "Preparación de un manuscrito que cumpla con la Información Mínima sobre un Experimento de Citometría de Flujo (MIFlowCyt) utilizando el Repositorio de Archivos FCS de la Sociedad Internacional para el Avance de la Citometría (ISAC) (FlowRepository.org)". En J. Paul Robinson (ed.). Preparación de un manuscrito que cumpla con la Información Mínima sobre un Experimento de Citometría de Flujo (MIFlowCyt ) utilizando el Repositorio de Archivos FCS de la Sociedad Internacional para el Avance de la Citometría (ISAC) (FlowRepository.org ) . Current Protocols in Cytometry. Vol. Capítulo 10. pp. Unidad Un10.18. doi : 10.1002/0471142956.cy1018s61 . ISBN   978-0-471-14295-9. PMID 22752950 . S2CID 24921940 .  
  81. ↑ "FlowRepository" .
  82. ↑ "FlowCAP - Citometría de flujo: evaluación crítica de los métodos de identificación de poblaciones" . Consultado el 15 de marzo de 2013 .
  83. ↑ "Conjunto de datos del estudio de historia natural del VIH del IDCRP" . Consultado el 3 de marzo de 2013 .
  84. ↑ Craig, FE; Brinkman, RR; Eyck, ST; Aghaeepour, N. (2013). "El análisis computacional optimiza la evaluación por citometría de flujo para el linfoma". Cytometry Part B : n/a. doi : 10.1002/cytob.21115 (inactivo el 15 de octubre de 2025). PMID 23873623 . {{cite journal}}: CS1 maint: DOI inactivo desde octubre de 2025 ( enlace )
  85. ↑ Villanova, F.; Di Meglio, P.; Inokuma, M.; Aghaeepour, N.; Perucha, E.; Mollon, J.; Nomura, L.; Hernandez-Fuentes, M.; Cope, A.; Prevost, AT; Heck, S.; Maino, V.; Lord, G.; Brinkman, RR; Nestle, FO (2013). Von Herrath, Matthias G (ed.). "Integración de la citometría de flujo basada en Lyoplate y el análisis computacional para el descubrimiento estandarizado de biomarcadores inmunológicos" . PLOS ONE . 8 (7) e65485. Bibcode : 2013PLoSO...865485V . doi : 10.1371/journal.pone.0065485 . PMC 3701052 . PMID 23843942 .  
  86. 1 2 Maecker, HT; McCoy, JP; Nussenblatt, R. (2012). "Estandarización del inmunofenotipado para el Proyecto de Inmunología Humana" . Nature Reviews Immunology . 12 (3): 191– 200. doi : 10.1038/nri3158 . PMC 3409649. PMID 22343568 .  
  87. 1 2 3 4 Schadt, EE; Linderman, MD; Sorenson, J.; Lee, L.; Nolan, GP (2010). " Soluciones computacionales para la gestión y el análisis de datos a gran escala" . Nature Reviews Genetics . 11 (9): 647– 657. doi : 10.1038/nrg2857 . PMC 3124937. PMID 20717155 .