Clasificación de espermatozoides

Se han utilizado varios métodos para clasificar los espermatozoides antes de la llegada de la citometría de flujo. La centrifugación en gradiente de densidad (en un gradiente continuo o discontinuo) puede concentrar muestras de semen con baja concentración de espermatozoides, utilizando la densidad de los espermatozoides como medida de su calidad. ^{[ 1 ] [ 2 ]} De manera similar, las llamadas técnicas de migración ascendente aplican un paso de centrifugación y luego se permite que los espermatozoides naden hacia arriba en un medio, enriqueciendo así una subpoblación de espermatozoides móviles. Sin embargo, el uso de la centrifugación de espermatozoides es perjudicial para la viabilidad de los espermatozoides y provoca la producción de especies reactivas de oxígeno. ^{[ 1 ]} Las técnicas convencionales se utilizan de forma rutinaria en la tecnología de reproducción asistida. ^{[ 3 ]}

La citometría de flujo es otro método utilizado para clasificar espermatozoides, y las adaptaciones de esta técnica abren nuevas oportunidades en la clasificación de espermatozoides. Sin embargo, debido a que la clasificación de espermatozoides basada en citometría de flujo suele utilizar colorantes fluorescentes que a menudo tiñen el ADN, la seguridad de esta técnica en la medicina reproductiva humana es objeto de debate científico. ^{[ 4 ] [ 5 ]}

Sin embargo, la citometría de flujo es la única técnica actualmente utilizada capaz de determinar el sexo de la futura descendencia midiendo el contenido de ADN de los espermatozoides individuales. Evalúa si contienen el cromosoma X más grande (dando lugar a una descendencia femenina) o el cromosoma Y más pequeño (dando lugar a una descendencia masculina). Luego permite la separación de los espermatozoides X e Y. ^{[ 6 ]} La llamada tecnología de sexado de espermatozoides de Beltsfield fue desarrollada por el USDA en conjunto con los Laboratorios Nacionales Lawrence Livermore, basándose en la diferencia de ADN entre los cromosomas X e Y. ^{[ 7 ]} Antes de la clasificación por citometría de flujo, el semen se marca con un colorante fluorescente llamado Hoechst 33342 que se une al ADN de cada espermatozoide. Como el cromosoma X es más grande (es decir, tiene más ADN) que el cromosoma Y, los espermatozoides "femeninos" (portadores del cromosoma X) absorberán una mayor cantidad de colorante que sus contrapartes masculinas (portadores del cromosoma Y). Como consecuencia, al exponerse a la luz UV durante la citometría de flujo, los espermatozoides X presentan una fluorescencia más brillante que los espermatozoides Y. A medida que los espermatozoides pasan por el citómetro de flujo en fila india, cada espermatozoide queda encapsulado en una gota de fluido y se le asigna una carga eléctrica correspondiente a su estado cromosómico (p. ej., carga positiva para X, carga negativa para Y). El flujo de gotas X e Y se separa mediante desviación electrostática y se recoge en tubos de recolección separados para su posterior procesamiento. ^{[ 8 ]}

Otra técnica citométrica utilizada en la clasificación de espermatozoides es la clasificación celular activada magnéticamente (MACS), que se aplica de forma rutinaria en hospitales de reproducción asistida para separar los espermatozoides con ADN fragmentado. Esto se logra mediante el uso de anticuerpos contra marcadores de superficie de muerte celular programada ( apoptosis ), como la anexina V , acoplados a microesferas magnéticas. Tras la unión de estos anticuerpos, los espermatozoides que sufren apoptosis se separan aplicando un campo magnético a la suspensión de espermatozoides. ^{[ 9 ]} MACS elimina la necesidad de moléculas fluorescentes de unión al ADN.

El daño en el ADN de los espermatozoides puede detectarse mediante espectroscopia Raman . ^{[ 10 ]} Sin embargo, no es lo suficientemente específico para detectar características individuales. ^{[ 10 ]} Los espermatozoides con menor daño en el ADN pueden inyectarse posteriormente en el óvulo mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). ^{[ 10 ]} Se han propuesto o se están probando muchos otros métodos para la selección de espermatozoides. ^{[ 1 ] [ 3 ]}

Para seleccionar espermatozoides con un bajo índice de daño en el ADN, la población de espermatozoides podría enriquecerse con espermatozoides con ADN no fragmentado, mediante técnicas como la electroforesis , ^{[ 11 ]} el método Z ^{[ 12 ]} y MACS (clasificación celular por activación magnética), que en combinación con la centrifugación en gradiente de densidad en protocolos de preparación de espermatozoides individuales da como resultado espermatozoides de calidad superior. ^{[ 13 ]}

Los sitios de unión del ácido hialurónico (AH) en la membrana plasmática del espermatozoide son un indicador de la madurez espermática (Huszar et al., 2003; Yudin et al., 1999). Existen dos métodos basados ​​en este hecho: la inyección intracitoplasmática fisiológica de espermatozoides (PICSI) y un procedimiento de lavado de espermatozoides; ambos métodos requieren la preparación del esperma mediante lavado o centrifugación.

Los métodos convencionales de selección de espermatozoides se han utilizado ampliamente para evaluar la calidad del esperma antes de la inseminación artificial o la fertilización in vitro . Se ha comprobado que el esperma seleccionado mediante estas técnicas es de mayor calidad que el no seleccionado. ^{[ 14 ] [ 15 ]} Sin embargo, características importantes del esperma, como la integridad del ADN, no se evalúan con estos métodos convencionales. Las nuevas técnicas basadas en citometría de flujo, como la tinción con YO-PRO, pueden diferenciar los espermatozoides apoptóticos y muertos de los viables. ^{[ 2 ]} Por ejemplo, la tinción con anexina V seguida de MACS puede mejorar significativamente las tasas de embarazo en parejas con antecedentes de fallos en la reproducción asistida. ^{[ 9 ]}