Etiqueta fluorescente

Entre las especies comunes para las que se utilizan marcadores isotópicos se encuentran las proteínas. En este caso, los aminoácidos con isótopos estables de carbono, nitrógeno o hidrógeno se incorporan a las secuencias polipeptídicas. ^{[ 8 ]} Estos polipéptidos se someten luego a espectrometría de masas . Debido al cambio preciso y definido que estos isótopos producen en los péptidos, es posible determinar, mediante el gráfico de espectrometría, qué péptidos contienen los isótopos. De esta manera, se puede extraer la proteína de interés de entre varias otras en un grupo. Los compuestos isotópicos desempeñan un papel importante como fotocromos, como se describe más adelante.

Los biosensores se adhieren a una sustancia de interés. Normalmente, esta sustancia no podría absorber luz, pero con el biosensor adherido , la luz puede ser absorbida y emitida en un espectrofotómetro . ^{[ 9 ]} Además, los biosensores fluorescentes pueden observarse a simple vista. Algunos biosensores fluorescentes también tienen la capacidad de cambiar de color en entornos cambiantes (por ejemplo, de azul a rojo). Un investigador podría inspeccionar y obtener datos sobre el entorno circundante basándose en el color que observa en la molécula híbrida del biosensor. ^{[ 10 ]}

Los ensayos colorimétricos se utilizan normalmente para determinar la concentración de una especie en relación con otra. ^{[ 9 ]}

Los compuestos fotocrómicos tienen la capacidad de alternar entre una gama o variedad de colores. Su capacidad para mostrar diferentes colores radica en cómo absorben la luz. Las distintas manifestaciones isoméricas de la molécula absorben diferentes longitudes de onda de luz, de modo que cada especie isomérica puede mostrar un color diferente según su absorción. Entre estos se incluyen los compuestos fotosensibles, que son proteínas que pueden pasar de un estado no fluorescente a uno fluorescente en un entorno determinado. ^{[ 11 ]}

La molécula orgánica más común que se utiliza como fotocromo es el diarileteno . ^{[ 12 ]} Otros ejemplos de proteínas fotosensibles incluyen PADRON-C, rs-FastLIME-s y bs-DRONPA-s, que pueden utilizarse tanto en células vegetales como de mamíferos para observar el movimiento de las células hacia diferentes entornos. ^{[ 11 ]}

Los biomateriales fluorescentes representan una posible manera de utilizar factores externos para observar una vía metabólica de forma más visible. El método consiste en marcar fluorescentemente moléculas peptídicas que alteran la vía metabólica natural de un organismo. Al insertar este péptido en la célula del organismo, se puede inducir una reacción diferente. Este método puede utilizarse, por ejemplo, para tratar a un paciente y observar visualmente el resultado del tratamiento. ^{[ 13 ]}

Los sensores electroquímicos pueden utilizarse para la detección sin marcadores de biomoléculas. Detectan cambios y miden la corriente entre un electrodo metálico analizado y un electrolito que contiene el analito objetivo. A continuación, se aplica un potencial conocido al electrodo a partir de una corriente de retroalimentación y se puede medir la corriente resultante. Por ejemplo, una técnica que utiliza la detección electroquímica consiste en aumentar lentamente el voltaje, lo que provoca la oxidación o reducción de especies químicas en el electrodo. Se grafica la corriente de la celda en función del voltaje, lo que permite identificar la cantidad de especies químicas consumidas o producidas en el electrodo. ^{[ 14 ]} Se pueden utilizar marcadores fluorescentes junto con sensores electroquímicos para facilitar la detección en un sistema biológico .

De los diversos métodos de marcaje de biomoléculas, los marcadores fluorescentes son ventajosos porque son altamente sensibles incluso a bajas concentraciones y no dañan el plegamiento ni la función de la molécula objetivo. ^{[ 1 ]}

La proteína fluorescente verde (GFP) es una proteína fluorescente natural de la medusa Aequorea victoria que se utiliza ampliamente para marcar proteínas de interés. La GFP emite un fotón en la región verde del espectro de luz cuando se excita por la absorción de luz. El cromóforo consiste en un tripéptido oxidado -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 ubicado dentro de un barril β. La GFP cataliza la oxidación y solo requiere oxígeno molecular. La GFP se ha modificado cambiando la longitud de onda de la luz absorbida para incluir otros colores de fluorescencia. La proteína fluorescente amarilla (YFP) , la proteína fluorescente azul (BFP) y la proteína fluorescente cian (CFP) son ejemplos de variantes de GFP. Estas variantes se producen mediante ingeniería genética del gen de la GFP. ^{[ 15 ]}

Las sondas fluorescentes sintéticas también pueden utilizarse como marcadores fluorescentes. Entre las ventajas de estos marcadores se incluyen un tamaño menor y una mayor variedad de colores. Pueden utilizarse para marcar proteínas de interés de forma más selectiva mediante diversos métodos, como el marcaje basado en el reconocimiento químico, por ejemplo, utilizando péptidos quelantes de metales, y el marcaje basado en el reconocimiento biológico mediante reacciones enzimáticas. ^{[ 16 ]} Sin embargo, a pesar de su amplio rango de longitudes de onda de excitación y emisión, así como de su mayor estabilidad, las sondas sintéticas tienden a ser tóxicas para la célula, por lo que no se suelen utilizar en estudios de imagen celular. ^{[ 1 ]}

Se pueden hibridar marcadores fluorescentes con el ARNm para visualizar la interacción y la actividad, como la localización del ARNm. Una hebra antisentido marcada con la sonda fluorescente se une a una sola hebra de ARNm y se puede observar durante el desarrollo celular para ver el movimiento del ARNm dentro de la célula. ^{[ 17 ]}

Un fluorógeno es un ligando (ligando fluorogénico) que no es fluorescente por sí mismo, pero que cuando se une a una proteína o estructura de ARN específica se vuelve fluorescente. ^{[ 18 ]}

Por ejemplo, FAST es una variante de la proteína amarilla fotoactiva que fue diseñada para unirse a imitadores químicos del cromóforo tripéptido GFP. ^{[ 19 ]} De igual modo, el aptámero de espinaca es una secuencia de ARN diseñada que puede unirse a imitadores químicos del cromóforo GFP, confiriendo así fluorescencia condicional y reversible a las moléculas de ARN que contienen la secuencia. ^{[ 20 ]}

En el marcaje enzimático, primero se forma una estructura de ADN utilizando un gen y el ADN de una proteína fluorescente. ^{[ 21 ]} Tras la transcripción, se forma un híbrido de ARN + fluoróforo. El objeto de interés se une a una enzima que puede reconocer este ADN híbrido. Generalmente se utiliza fluoresceína como fluoróforo.

El marcaje químico o el uso de etiquetas químicas aprovecha la interacción entre una molécula pequeña y una secuencia genética específica de aminoácidos. ^{[ 22 ]} El marcaje químico se utiliza a veces como alternativa a la GFP. Las proteínas sintéticas que funcionan como sondas fluorescentes son más pequeñas que la GFP y, por lo tanto, pueden funcionar como sondas en una mayor variedad de situaciones. Además, ofrecen una gama más amplia de colores y propiedades fotoquímicas. ^{[ 23 ]} Con los avances recientes en el marcaje químico, las etiquetas químicas se prefieren a las proteínas fluorescentes debido a las limitaciones arquitectónicas y de tamaño del característico barril β de la proteína fluorescente. Las alteraciones de las proteínas fluorescentes provocarían la pérdida de sus propiedades fluorescentes. ^{[ 22 ]}

El marcaje de proteínas utiliza una etiqueta corta para minimizar la alteración del plegamiento y la función de la proteína. Se utilizan metales de transición para unir residuos específicos de las etiquetas a sitios diana específicos, como los extremos N-terminales, C-terminales o sitios internos dentro de la proteína. Ejemplos de etiquetas utilizadas para el marcaje de proteínas incluyen etiquetas biarénicas, etiquetas de histidina y etiquetas FLAG. ^{[ 1 ]}

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es un ejemplo de técnica de marcaje genético que utiliza sondas específicas para sitios cromosómicos a lo largo de un cromosoma, también conocida como tinción cromosómica . Múltiples colorantes fluorescentes, cada uno con una longitud de onda de excitación y emisión distinta, se unen a una sonda que luego se hibrida con los cromosomas. Un microscopio de fluorescencia detecta los colorantes presentes y envía la información a una computadora que revela el cariotipo de la célula. Esta técnica permite detectar anomalías como deleciones y duplicaciones. ^{[ 24 ]}

Los sensores de moléculas pequeñas son compuestos químicos que detectan ciertos iones metálicos en solución. ^{[ 25 ]} Aunque existen muchos tipos, la mayoría de los sensores de moléculas pequeñas constan de una subunidad que se une selectivamente a un metal, lo que a su vez induce un cambio en una subunidad fluorescente . Este cambio se puede observar en el espectro del sensor de molécula pequeña , que se puede monitorizar mediante un sistema de detección como un microscopio o un fotodiodo . ^{[ 26 ]} Existen diferentes sondas para diversas aplicaciones, cada una con diferentes constantes de disociación con respecto a un metal en particular, diferentes propiedades fluorescentes y sensibilidades. Estas sondas analizan procesos biológicos mediante la monitorización de iones metálicos a bajas concentraciones en sistemas biológicos. Los biosensores más tradicionales son menos eficaces o no son adecuados. ^{[ 27 ]} La mayoría de los mecanismos de detección implicados en los sensores de moléculas pequeñas implican fluorescencia. ^{[ 26 ] [ 28 ]}

Mecanismos de detección

• Extinción de fluorescencia paramagnética , la aparición de nuevos estados electrónicos al unirse a un átomo de metal paramagnético ^{[ 26 ].}
• Transferencia de electrones fotoinducida (PET) , el bloqueo de un estado de energía inferior debido a la unión de un átomo de metal. ^{[ 26 ]}
• Transferencia de carga fotoinducida (PCT) , la modulación de los niveles de energía en un complejo por transferencia de carga dentro de un sistema pi conjugado . ^{[ 26 ]}
• Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) , ^{[ 26 ]} la transferencia de un excitón de un donante a un aceptor, modulando el espectro de emisión . ^{[ 26 ] [ 29 ]}
• Formación de excímeros/exciplexos , la formación de un estado que es un híbrido de los estados fundamental y excitado. Esto tiene propiedades fluorescentes novedosas. ^{[ 26 ]}
• Quimiodosímetros , complejos que experimentan reacciones irreversibles con otras especies al unirse a un metal para formar nuevos compuestos con espectros fluorescentes novedosos. ^{[ 26 ]}

Los fluoróforos son esenciales para medir el evento de unión de metales e indirectamente, la concentración de metales. Existen muchos tipos, cada uno con propiedades diferentes que los hacen ventajosos para distintas aplicaciones. Algunos funcionan como pequeños sensores de metales completamente solos, mientras que otros deben ser complejados con una subunidad que pueda quelar o unirse a un ion metálico. La rodamina, por ejemplo, experimenta un cambio conformacional al unirse a un ion metálico. Al hacerlo, pasa de una forma espirocíclica incolora y no fluorescente a una forma cíclica abierta, rosa y fluorescente. ^{[ 26 ] [ 30 ]} Se han desarrollado sensores basados ​​en quinolina que forman complejos luminiscentes con Cd(II) y fluorescentes con Zn(II). Se hipotetiza que funcionan cambiando su estado luminiscente más bajo de n– π * a π – π * cuando se coordinan con un metal. ^{[ 26 ] [ 31 ] [ 32 ]} Cuando el grupo dansilo DNS se une a un metal, pierde un hidrógeno de sulfonamida , lo que provoca la extinción de la fluorescencia a través de un mecanismo PET o PET inverso en el que se transfiere un electrón hacia o desde el metal que está unido. ^{[ 33 ]}

Se han reportado sensores de moléculas pequeñas para zinc . ^{[ 28 ]} Un ejemplo es "ZX1", un compuesto que comprende una subunidad de unión de zinc de dipicolilamina (DPA) que tiene mayor afinidad por el zinc que otras especies encontradas en solución como Ca y Mg. ^{[ 34 ] [ 35 ]} GFZnP OMe es un sensor de Zn2+ fluorescente alternativo basado en GFP publicado para microscopía de dos fotones y aplicaciones biológicas y de microscopía relacionadas. Está compuesto por un andamio de 8-metoxiquinolina. Tiene excelentes características fotofísicas incluyendo una mejora de fluorescencia de 37 veces con l(ex) = 440 nm y l(em) = 505 nm. La sección transversal de dos fotones es tan alta como 73 GM a 880 nm. ^{[ 36 ]} GFZnP BIPY presenta una fracción quelante de 2,2'-bipiridina. Se demostró su eficacia en un rango de pH fisiológicamente relevante y se reportaron excelentes características fotofísicas, incluyendo un aumento de fluorescencia de 53 veces con máximos de excitación y emisión a 422 nm y 492 nm, respectivamente. Se reportó una alta sección transversal de dos fotones de 3,0 GM a 840 nm, así como una excelente selectividad para iones metálicos. Se realizaron experimentos in vitro en cultivos de células HEK 293 mediante microscopía de dos fotones, demostrando su aplicabilidad. ^{[ 37 ]}

Para el cobre, el sensor CTAP-1 muestra una respuesta en la región UV cuando el Cu(I) se une a un motivo de azatetratiacorona que a su vez excita un colorante a base de pirazolina que está unido. ^{[ 27 ] [ 28 ]} En Coppersensor-1 (CS1), un motivo rico en tioéter se une al Cu(I) causando la excitación de un colorante de borodipirrometeno ( BODIPY ) en la región visible. ^{[ 27 ] [ 28 ]}

Los sensores de hierro incluyen Pryrene-TEMPO, en el que la unión del hierro a TEMPO extingue la fluorescencia del pireno cuando no hay Fe(II) unido. Sin embargo, tras la unión, TEMPO se reduce y el pireno recupera la fluorescencia. Esta sonda tiene la limitación de que se puede generar una respuesta análoga por radicales libres no deseados y que solo se puede usar en solución ácida. ^{[ 28 ] [ 38 ]} El sistema de unión de Fe(II) DansSQ consiste en un grupo dansilo unido a estirilquinolina y funciona mediante la interrupción de la transferencia de carga intramolecular. Tiene la limitación de que solo es soluble en acetonitrilo en _H₂O al 10 % . ^{[ 28 ]}

Se han fabricado sensores de cobalto que aprovechan la ruptura de los enlaces CO por el Co(II) en una sonda fluorescente conocida como Sonda de Cobalto 1 (CP1). ^{[ 39 ]}

Se pueden prever posibles aplicaciones para la detección de mercurio en peces . ^{[ 40 ]} Algunos sensores de mercurio (MS) son complejos de fluoresceína y naftofluoresceína. La sonda MS1 aumenta su emisión al unirse a Hg(II), manteniendo una gran afinidad por el mercurio frente a otros iones de metales pesados. ^{[ 27 ]} El sensor S3 se basa en un complejo BODIPY que experimenta un aumento significativo de la fluorescencia al unirse a Hg(II). ^{[ 27 ] [ 41 ]} MF1 utiliza un quelante de tioéter suave para Hg(II) unido a un reportero de xantenona similar a la fluoresceína. Presenta un buen contraste al unirse al mercurio y una buena selectividad. MF1 es lo suficientemente sensible como para que se haya propuesto su uso para analizar peces en busca de niveles tóxicos de mercurio. ^{[ 27 ] [ 40 ]}