GESTALT

La edición genómica de matrices de objetivos sintéticos para el rastreo de linajes ( GESTALT ) es un método utilizado para determinar los linajes de desarrollo de las células en sistemas multicelulares. ^{[ 1 ]} GESTALT implica la introducción de un pequeño código de barras de ADN que contiene sitios objetivo CRISPR/Cas9 espaciados regularmente en los genomas de las células progenitoras. Junto con el código de barras, se introducen Cas9 y sgRNA en las células. Las mutaciones en el código de barras se acumulan durante el curso de las divisiones celulares y la combinación única de mutaciones en el código de barras de una célula se puede determinar mediante secuenciación de ADN o ARN para vincularla a un linaje de desarrollo.

El mapeo del destino celular es el proceso de identificar los orígenes embrionarios de los tejidos adultos. El rastreo de linaje es más específico y abarca métodos que examinan la progenie que surge de una o pocas células. ^{[ 2 ]} Uno de los primeros métodos de rastreo de linaje desarrollados implicó la inyección de colorantes en células específicas de un embrión temprano, etiquetándolas así a ellas y a su progenie en cada división celular. ^{[ 3 ]} Métodos posteriores utilizaron el marcaje retroviral, empleando retrovirus para introducir un gen marcador como la proteína fluorescente o la beta-galactosidasa en los genomas de las células de interés, lo que resultó en la expresión constitutiva del marcador en esas células y su progenie. ^{[ 4 ]} Estos métodos tienen el inconveniente de ser invasivos y relativamente difíciles de dirigir a las células que se deben marcar. ^{[ 2 ]} Actualmente, el enfoque más utilizado implica el marcaje celular a través de sistemas de recombinación genética . Estos métodos utilizan recombinasas , siendo los dos principales los sistemas Cre-loxP y Flp-firt , que pueden eliminar segmentos de ADN flanqueados por los sitios loxP y frt, respectivamente. ^{[ 5 ] [ 6 ]} En este método, se crea un modelo transgénico que puede expresar la recombinasa Cre y tiene un gen reportero con un casete de parada aguas arriba flanqueado por sitios loxP. La recombinación Cre elimina el casete de parada aguas arriba de un gen reportero, permitiendo la expresión del reportero. ^{[ 7 ]} El control espacial sobre las células marcadas se logra utilizando alelos Cre específicos bajo los elementos de control de un gen marcador elegido, y el control temporal se puede obtener si se utilizan alelos Cre inducibles. ^{[ 7 ]} Por ejemplo, CreERT solo tiene actividad de recombinación activa tras la administración de tamoxifeno . ^{[ 8 ]} Aunque potente, requiere una optimización significativa para facilitar el rastreo del linaje de células individuales y tiene un bajo rendimiento. ^{[ 9 ]} Han comenzado a surgir métodos de rastreo de linaje basados ​​en secuenciación, ya que proporcionan un rastreo de destino celular significativamente más rápido y de alto rendimiento. ^{[ 9 ] [ 10 ]} Los primeros enfoques aprovecharon las mutaciones somáticas que ocurren naturalmente para identificar las relaciones de linaje celular. ^{[ 11 ]}

GESTALT aprovecha el sistema CRISPR-Cas9, que permite dirigir las roturas de doble cadena en el ADN a sitios altamente específicos adyacentes a los motivos PAM según la secuencia del sgRNA. ^{[ 12 ]} Estas roturas son luego reparadas por uno de los mecanismos endógenos del ADN celular: reparación del ADN por unión de extremos no homólogos o reparación dirigida por homología . ^{[ 12 ]} La unión de extremos no homólogos es la más activa de las dos vías de reparación, lo que resulta en inserciones/deleciones en el sitio objetivo. ^{[ 13 ]} El sistema GESTALT utiliza una matriz de diez objetivos CRISPR/Cas9, con el primer sitio que tiene una especificidad perfecta para el sgRNA diseñado, y los otros nueve tienen menos actividad Cas9 debido a desajustes con el sgRNA. ^{[ 1 ]} La introducción de los reactivos CRISPR-Cas9 en células que contienen este conjunto provocará la acumulación de inserciones/deleciones en potencialmente cada objetivo del conjunto, marcando la célula con una secuencia de código de barras única que puede utilizarse para identificarla a ella y a su progenie mediante secuenciación de ADN o ARN. ^{[ 1 ]}

GESTALT de célula única (scGESTALT) amplía el sistema GESTALT mediante la integración de la captura simultánea de información de código de barras y transcriptoma utilizando scRNA-seq . ^{[ 19 ]} En scGESTALT, el código de barras se clona en células progenitoras de interés aguas abajo de un promotor inducible. Cuando se completa el período de desarrollo, se induce la expresión del código de barras y el ARNm del código de barras se secuencia junto con el resto del transcriptoma utilizando scRNA-seq. ^{[ 19 ]} Los datos transcriptómicos se pueden utilizar para rastrear la diferenciación del tipo celular, mientras que los códigos de barras se pueden utilizar para crear relaciones de desarrollo con otras células. Una mejora adicional es la capacidad de inducir el marcaje en dos momentos diferentes. Esto se posibilita mediante la clonación de Cas9/sgRNA bajo un promotor de choque térmico ; el primer evento de marcaje se induce mediante microinyección como en GESTALT tradicional, mientras que un segundo período de marcaje posterior se inicia mediante la expresión de Cas9 y sgRNA inducida por choque térmico. ^{[ 19 ]} Esto permite rastrear el linaje durante etapas posteriores del desarrollo, más allá de lo que es posible con GESTALT.

• GESTALT se limita a la embriogénesis temprana porque la microinyección de Cas9 y sgRNA solo es viable cuando se realiza en un número reducido de células progenitoras. ^{[ 1 ]} Como resultado, la edición de códigos de barras se restringe al desarrollo temprano, lo que significa que no es posible descifrar las relaciones de linaje posteriores. Esta limitación se abordó parcialmente con el desarrollo de scGESTALT y métodos relacionados con sistemas de expresión inducibles de Cas9 y sgRNA que permiten el marcaje en etapas posteriores del desarrollo. ^{[ 19 ]}
• Las secuencias de código de barras de GESTALT por sí solas no proporcionan ninguna información sobre el tipo de célula en la que se identificó el código de barras. scGESTALT aborda este problema al vincular los códigos de barras con el transcriptoma de la célula, lo que permite determinar la identidad celular. ^{[ 19 ]}
• En una parte de las células, las deleciones superpuestas pueden provocar la pérdida de marcas previamente acumuladas en la región del código de barras, lo que resulta en la pérdida de información de linaje. ^{[ 1 ]}
• Es posible que una edición similar o idéntica pueda surgir por casualidad en células pertenecientes a dos linajes distintos, lo que resulta en la asociación errónea de esos linajes. ^{[ 1 ]}
• scGESTALT sufre los mismos problemas de pérdida observados en los métodos de célula única. ^{[ 20 ]} Las secuencias de código de barras solo se capturan en el 30% de las células. ^{[ 19 ]} Además, algunos tipos de células pueden silenciar la expresión del constructo de código de barras, lo que resulta en la pérdida de información de linaje para ese tipo de célula. ^{[ 9 ]}

GESTALT se desarrolló inicialmente para examinar las contribuciones de los progenitores embrionarios a los sistemas de órganos adultos del pez cebra . ^{[ 1 ]} Mediante la secuenciación de los códigos de barras de extracciones masivas de sistemas de órganos, se descubrió que cada órgano poseía solo un pequeño número de alelos del código de barras , lo que indica que los órganos surgen de la expansión clonal de un pequeño número de progenitores tempranos. ^{[ 1 ]} La información de linaje de miles de células diferenciadas se capturó en el experimento y demostró las capacidades de rastreo de linaje de alto rendimiento de GESTALT. ^{[ 1 ]}

scGESTALT se ha utilizado para refinar el árbol de linaje del cerebro del pez cebra. ^{[ 19 ]} La existencia de progenitores multipotentes que dan origen a células que migran a través del cerebro se descubrió después de un experimento de scGESTALT donde se capturaron algunas secuencias de código de barras en poblaciones celulares en el prosencéfalo, el mesencéfalo y el rombencéfalo. ^{[ 19 ]} Se encontró que las trayectorias de pseudotiempo generadas utilizando los datos de scRNA-seq para progenitores de oligodendrocitos a oligodendrocitos , así como progenitores atoh1c ^{+ a neuronas} pax6b ^+, eran consistentes con la distribución del código de barras en esos tipos de células. ^{[ 19 ]}

• La técnica MEMOIR (Memory by Engineered Mutagenesis with Optical In Situ Readout) es un método de rastreo de linaje relacionado que se basa en la modificación de un código de barras mediante Cas9/gRNA. ^{[ 21 ]} Existen dos diferencias principales con GESTALT. En primer lugar, en lugar de introducir mutaciones en un código de barras, en MEMOIR el Cas9-sgRNA elimina regiones del código de barras. En segundo lugar, en lugar de la secuenciación tradicional, MEMOIR emplea hibridación fluorescente de ARN de molécula única multiplexada secuencial (seqFISH) para leer in situ el código de barras dentro de células individuales.
• El rastreo de linajes mediante la edición activada por nucleasas de secuencias ubicuas (LINNAEUS) es un intento de mejorar scGESTALT. ^{[ 22 ]} En LINNAEUS, el código de barras se reemplaza con múltiples genes reporteros transgénicos que son el objetivo de Cas9/sgRNA. Los genes reporteros se distribuyen por todo el genoma, lo que garantiza que la edición posterior con Cas9 no sobrescriba la edición previa.
• ScarTrace es un método basado en los mismos principios que scGESTALT. Rastrea los linajes celulares mediante la edición con Cas9/sgRNA de un código de barras compuesto por ocho copias en tándem de un transgén de proteína verde fluorescente (GFP) de histona. ^{[ 23 ]} ScarTrace integra datos de scRNA-seq para el análisis del tipo celular, pero en lugar de secuenciar únicamente el código de barras a partir del ARNm, como en scGESTALT, ScarTrace también utiliza una PCR anidada para amplificar el código de barras a partir del ADN genómico. Se afirma que esto es más fiable, ya que el código de barras de ARNm podría ser inestable o estar silenciado en determinadas situaciones. ^{[ 23 ]}