Sistema de reporteros GUS

El sistema reportero GUS ( GUS : β-glucuronidasa ) es un sistema de genes reporteros , particularmente útil en biología molecular vegetal ^{[ 1 ]} y microbiología ^{[ 2 ]} . Existen varios tipos de ensayos con el gen reportero GUS, según el sustrato utilizado. El término tinción GUS se refiere a la más común de ellas, una técnica histoquímica .

El propósito de esta técnica es analizar la actividad de un promotor de transcripción génica (en términos de la expresión de un gen reportero bajo el control regulador de dicho promotor) ya sea de manera cuantitativa, mediante la medición de la actividad, o cualitativa (activación o desactivación) a través de la visualización de su actividad en diferentes células, tejidos u órganos. La técnica utiliza el gen uidA de Escherichia coli , que codifica la enzima β-glucuronidasa ; ^{[ 3 ]} esta enzima, al incubarse con sustratos específicos incoloros o no fluorescentes , puede convertirlos en productos estables coloreados o fluorescentes . ^{[ 4 ]} La presencia del color inducido por GUS indica dónde se ha expresado activamente el gen. De esta manera, una fuerte actividad del promotor produce una tinción intensa y una actividad débil produce una tinción menor.

El gen uidA también puede fusionarse con un gen de interés, creando una fusión genética . La inserción del gen uidA provocará la producción de GUS, que posteriormente puede detectarse utilizando diversos glucurónidos como sustratos. ^{[ 4 ]}

Existen diferentes glucurónidos posibles que pueden usarse como sustratos para la β-glucuronidasa, dependiendo del tipo de detección necesaria ( histoquímica , espectrofotométrica , fluorimétrica ). El sustrato más común para la tinción histoquímica de GUS es el 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurónido ( X-Gluc ). El X-Gluc es hidrolizado por GUS en el producto 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo (diX-índigo). El DiX-índigo aparecerá azul y puede verse mediante microscopía óptica. ^{[ 5 ]} Este proceso es análogo a la hidrólisis de X-gal por la β-galactosidasa ^{[ 5 ]} para producir células azules como se practica comúnmente en los ensayos de genes reporteros bacterianos.

Para otros tipos de detección, los sustratos comunes son el p-nitrofenil β-D-glucurónido para el ensayo espectrofotométrico y el 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) para el ensayo fluorimétrico. ^{[ 6 ]}

El sistema fue desarrollado originalmente por Richard Anthony Jefferson durante su doctorado en la Universidad de Colorado en Boulder . ^{[ 7 ]} Adaptó la técnica para su uso con plantas mientras trabajaba en el Instituto de Mejora Genética Vegetal de Cambridge , entre 1985 y 1987. ^{[ 1 ]} Desde entonces, miles de laboratorios han utilizado el sistema, convirtiéndolo en una de las herramientas más utilizadas en biología molecular vegetal, como lo demuestran las miles de citas en la literatura científica. ^{[ 7 ]}

Un organismo es adecuado para un ensayo GUS si carece de actividad β-glucuronidasa natural o si la actividad es muy baja ( actividad basal ). Por esta razón, el ensayo no es útil en la mayoría de los vertebrados y muchos moluscos . ^{[ 6 ]} Dado que no hay actividad GUS detectable en plantas superiores , musgos , algas , helechos , hongos y la mayoría de las bacterias , ^{[ 6 ]} el ensayo es ideal para estudios de expresión génica en estos organismos y se considera el gen reportero de elección en ciencias vegetales.

El ensayo GUS no requiere la presencia de cofactores ni iones para su funcionamiento. La beta-glucuronidasa puede funcionar en un amplio rango de valores de pH y es bastante resistente a la inactivación térmica. ^{[ 8 ]} Sin embargo, la GUS es susceptible a la inhibición por ciertos iones de metales pesados, como Cu ²⁺ y Zn ²⁺ .

Además, la interpretación del ensayo se ve limitada por el movimiento del diX-índigo a través de la célula. El diX-índigo puede asociarse con lípidos y difundirse lejos del sitio de actividad enzimática, lo que muestra una falta de localización citosólica e irregularidad en la penetración del sustrato. Esto puede conducir a una interpretación incorrecta de la localización de la proteína GUS. ^{[ 9 ]} A pesar de la falta de localización celular, se ha observado claramente la localización nuclear de GUS. ^{[ 10 ]} Los ensayos de GUS pueden realizarse en presencia de ferricianuro de potasio para evitar la difusión del colorante. ^{[ 5 ]}

El sistema GUS no es el único sistema de reportero genético disponible para el análisis de la actividad promotora. Existen otros sistemas alternativos basados, por ejemplo, en luciferasa , GFP , beta-galactosidasa , cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y fosfatasa alcalina . La elección de uno u otro sistema depende principalmente del organismo de interés y de las tecnologías de imagen y microscopía disponibles en los laboratorios que realizan la investigación.

El ensayo GUS, al igual que otros sistemas de genes reporteros, puede utilizarse para estudios distintos al ensayo clásico de actividad promotora. Los sistemas reporteros se han empleado para determinar la eficacia de los sistemas de transferencia génica, la localización intracelular de un producto génico, la detección de interacciones proteína-proteína o proteína-ADN, la eficacia de las señales de iniciación de la traducción y el éxito de los esfuerzos de clonación molecular.