LABRANZA (biología molecular)

TILLING ( Targeting Induced Local Lesions in Genomes ) es un método de biología molecular que permite la identificación dirigida de mutaciones en un gen específico . TILLING se introdujo en 2000, utilizando la planta modelo Arabidopsis thaliana , y se amplió a otros usos y metodologías por un pequeño grupo de científicos, incluido Luca Comai . Desde entonces, TILLING se ha utilizado como método de genética inversa en otros organismos como el pez cebra , el maíz , el trigo , el arroz , la soja , el tomate y la lechuga .

Descripción general

El método combina una técnica estándar y eficiente de mutagénesis utilizando un mutágeno químico como el metanosulfonato de etilo (EMS) con una técnica de detección de ADN sensible que identifica mutaciones de una sola base (también llamadas mutaciones puntuales) en un gen objetivo. El método TILLING se basa en la formación de heterodúplex de ADN que se forman cuando se amplifican múltiples alelos mediante PCR y luego se calientan y enfrían lentamente. Se forma una " burbuja " en el desajuste de las dos hebras de ADN, que luego es escindida por una nucleasa monocatenaria . Luego, los productos se separan por tamaño en varias plataformas diferentes (ver a continuación).

Los desajustes pueden deberse a mutaciones inducidas, heterocigosidad dentro de un individuo o variación natural entre individuos.

EcoTILLING ^[1]^[2]^[3]^[4] es un método que utiliza técnicas TILLING para buscar mutaciones naturales en individuos, generalmente para análisis genéticos de poblaciones. DEcoTILLING ^[5] es una modificación de TILLING y EcoTILLING que utiliza un método económico para identificar fragmentos. Desde la aparición de las tecnologías de secuenciación NGS , se ha desarrollado TILLING-by-sequencing ^[6] basado en la secuenciación Illumina de genes diana amplificados a partir de plantillas agrupadas multidimensionalmente para identificar posibles cambios de un solo nucleótido.

Enzimas de escisión de cadena sencilla

Existen varias fuentes de nucleasas monocatenarias. La primera enzima ampliamente utilizada fue la nucleasa de frijol mungo , pero se ha demostrado que esta nucleasa tiene una alta actividad no específica y solo funciona a un pH bajo, lo que puede degradar los productos de PCR y los cebadores marcados con colorante. La fuente original de la nucleasa monocatenaria era CEL1 o CJE (extracto de jugo de apio), pero otros productos han ingresado al mercado, incluidas las enzimas SNiPerase de Frontier Genomics, que se han optimizado para su uso en plataformas que utilizan productos de PCR marcados y no marcados (consulte la siguiente sección). Transgenomic aisló la proteína nucleasa monocatenaria y la vende como una forma recombinante. La ventaja de la forma recombinante es que, a diferencia de las mezclas de enzimas, no contiene actividad nucleasa no específica, que puede degradar los colorantes en los cebadores de PCR. La desventaja es un costo sustancialmente más alto.

Separación de productos escindidos

El primer artículo que describe TILLING utilizó HPLC para identificar mutaciones (McCallum et al., 2000a). El método se hizo más eficiente mediante el uso de la enzima de restricción Cel-I combinada con el sistema basado en gel LICOR para identificar mutaciones (Colbert et al., 2001). Las ventajas de utilizar este sistema son que los sitios de mutación se pueden confirmar y diferenciar fácilmente del ruido. Esto se debe a que se pueden utilizar colorantes de diferentes colores para los cebadores directos e inversos. Una vez que los productos de escisión se han ejecutado en un gel, se pueden ver en canales separados y, al igual que un RFLP, los tamaños de los fragmentos dentro de un carril en cada canal deben sumarse al tamaño completo del producto. Las ventajas del sistema LICOR son la separación de fragmentos grandes (~ 2 kb), el alto rendimiento de las muestras (96 muestras cargadas en peines de papel) y el software gratuito para identificar las mutaciones (GelBuddy). Las desventajas del sistema LICOR son tener que verter geles en losas y los largos tiempos de ejecución (~ 4 horas). Los métodos TILLING y EcoTILLING ahora se utilizan en sistemas capilares de Advanced Analytical Technologies, ABI y Beckman.

Se pueden utilizar varios sistemas para separar los productos de PCR que no están marcados con colorantes. Los sistemas de electroforesis de agarosa simples separarán los productos de escisión de manera económica y con equipo de laboratorio estándar. Esto se utilizó para descubrir SNP en salmón chum y se denominó DEcoTILLING. La desventaja de este sistema es la resolución reducida en comparación con los sistemas de poliacrilamida. Elchrom Scientific vende geles Spreadex que están prefabricados, pueden tener un alto rendimiento y son más sensibles que los geles de poliacrilamida estándar. Advanced Analytical Technologies Inc vende el sistema fluorescente AdvanCE FS96 dsDNA, que es un sistema de electroforesis capilar de 96 que tiene varias ventajas sobre los métodos tradicionales; incluida la capacidad de separar fragmentos grandes (hasta 40 kb), no requiere un paso de desalinización o precipitación, tiempos de ejecución cortos (~30 minutos), sensibilidad a 5 pg/ul y no necesita cebadores marcados con fluorescencia.

Centros de labranza

Existen en todo el mundo varios centros de labranza que se centran en especies de importancia agrícola:

Arroz – UC Davis (Estados Unidos)
Maíz – Universidad de Purdue (EE.UU.)
Brassica napus – Universidad de Columbia Británica (CA)
Brassica rapa – Centro John Innes (Reino Unido)
Arabidopsis – Investigación sobre el cáncer de Fred Hutchinson
Soja – Universidad del Sur de Illinois (EE.UU.)
Lotus y Medicago – Centro John Innes (Reino Unido)]
Trigo – UC Davis (EE. UU.)
Guisante, Tomate - INRA (Francia)
Tomate - RTGR, Universidad de Hyderabad (India)

Referencias

^ Comai, L. ; Young, K.; Till, BJ; Reynolds, SH; Greene, EA; Codomo, CA; Enns, LC; Johnson, JE; Burtner, C.; Odden, AR; Henikoff, S. (2004). "Descubrimiento eficiente de polimorfismos de ADN en poblaciones naturales mediante Ecotilling". The Plant Journal . 37 (5): 778–786. doi :10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x. PMID 14871304.
^ Gilchrist, EJ; Haughn, GW; Ying, CC; Otto, SP; Zhuang, J.; Cheung, D.; Hamberger, B.; Aboutorabi, F.; Kalynyak, T.; Johnson, LEE; Bohlmann, J.; Ellis, BE; Douglas, CJ; Cronk, QCB (2006). "Uso de Ecotilling como una herramienta eficiente de descubrimiento de SNP para estudiar la variación genética en poblaciones silvestres de Populus trichocarpa". Ecología molecular . 15 (5): 1367–1378. Bibcode :2006MolEc..15.1367G. doi :10.1111/j.1365-294X.2006.02885.x. PMID 16626459. S2CID 16198260.
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^ Nieto, C.; Pirón, F.; Dalmais, M.; Marco, CF; Moriones, E.; Gómez-Guillamón, ML; Truniger, V.; Gómez, P.; García-Más, J.; Aranda, MA; Bendahmane, A. (2007). "EcoTILLING para la identificación de variantes alélicas de melón eIF4E, factor que controla la susceptibilidad al virus". Biología vegetal BMC . 7 : 34. doi : 10.1186/1471-2229-7-34 . PMC 1914064 . PMID 17584936.
^ Garvin, MR; Gharrett, AJ (2007). "DEco-TILLING: Un método económico para el descubrimiento de polimorfismos de un solo nucleótido que reduce el sesgo de verificación". Notas de ecología molecular . 7 (5): 735–746. doi :10.1111/j.1471-8286.2007.01767.x.
^ Tsai, Helen; Howell, Tyson; Nitcher, Rebecca; Missirian, Victor; Watson, Brian; Ngo, Kathie J.; Lieberman, Meric; Fass, Joseph; Uauy, Cristobal; Tran, Robert K.; Khan, Asif Ali; Filkov, Vladimir; Tai, Thomas H.; Dubcovsky, Jorge; Comai, Luca (2011). "Descubrimiento de mutaciones raras en poblaciones: TILLING por secuenciación". Fisiología vegetal . 156 (3): 1257–1268. doi :10.1104/pp.110.169748. PMC 3135940 . PMID 21531898.

Literatura científica

Colbert, T; Till, BJ; Tompa, R; Reynolds, S; Steine, MN; Yeung, AT; McCallum, CM; Comai, L ; Henikoff, S (Jun 2001). "Cribado de alto rendimiento para mutaciones puntuales inducidas". Plant Physiol . 126 (2): 480–4. doi :10.1104/pp.126.2.480. PMC 1540114 . PMID 11402178.
Draper, BW; McCallum, CM; Stout, JL; Slade, AJ; Moens, CB (2004). "Un método de alto rendimiento para identificar mutaciones puntuales inducidas por N-etil-N-nitrosourea (ENU) en el pez cebra". El pez cebra: genética, genómica e informática . Métodos en biología celular. Vol. 77. págs. 91–112. doi :10.1016/s0091-679x(04)77005-3. ISBN 9780125641722. Número de identificación personal 15602907. {{cite book}}: |journal=ignorado ( ayuda )
McCallum, CM; Comai, L ; Greene, EA; Henikoff, S (abril de 2000). "Cribado dirigido para mutaciones inducidas". Nat Biotechnol . 18 (4): 455–7. doi :10.1038/74542. PMID 10748531. S2CID 12063367.
McCallum, CM; Comai, L ; Greene, EA; Henikoff, S (junio de 2000). "Dirigir las lesiones locales inducidas en genomas (TILLING) para la genómica funcional de plantas". Plant Physiol . 123 (2): 439–42. doi :10.1104/pp.123.2.439. PMC 1539256. PMID 10859174 .
Slade, AJ; Fuerstenberg, SI; Loeffler, D; Steine, MN; Facciotti, D (enero de 2005). "Un enfoque genético inverso, no transgénico para el mejoramiento del cultivo de trigo mediante TILLING". Nat Biotechnol . 23 (1): 75–81. doi :10.1038/nbt1043. PMID 15580263. S2CID 12109468.

Enlaces externos

El proyecto de labranza de Arabidopsis
Introducción a la labranza
Proyecto TILLING de pez cebra
Proyecto de mutación del pez cebra del Instituto Sanger

[1] Comai, L. ; Young, K.; Till, BJ; Reynolds, SH; Greene, EA; Codomo, CA; Enns, LC; Johnson, JE; Burtner, C.; Odden, AR; Henikoff, S. (2004). "Descubrimiento eficiente de polimorfismos de ADN en poblaciones naturales mediante Ecotilling". The Plant Journal . 37 (5): 778–786. doi :10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x. PMID 14871304.

[2] Gilchrist, EJ; Haughn, GW; Ying, CC; Otto, SP; Zhuang, J.; Cheung, D.; Hamberger, B.; Aboutorabi, F.; Kalynyak, T.; Johnson, LEE; Bohlmann, J.; Ellis, BE; Douglas, CJ; Cronk, QCB (2006). "Uso de Ecotilling como una herramienta eficiente de descubrimiento de SNP para estudiar la variación genética en poblaciones silvestres de Populus trichocarpa". Ecología molecular . 15 (5): 1367–1378. Bibcode :2006MolEc..15.1367G. doi :10.1111/j.1365-294X.2006.02885.x. PMID 16626459. S2CID 16198260.

[3] Mejlhede, N.; Kyjovska, Z.; Backes, G.; Burhenne, K.; Rasmussen, SK; Jahoor, A. (2006). "EcoTILLING para la identificación de variación alélica en los genes de resistencia al mildiú polvoroso mlo y Mla de la cebada" (PDF) . Fitomejoramiento . 125 (5): 461–467. doi :10.1111/j.1439-0523.2006.01226.x. S2CID 62901355.

[4] Nieto, C.; Pirón, F.; Dalmais, M.; Marco, CF; Moriones, E.; Gómez-Guillamón, ML; Truniger, V.; Gómez, P.; García-Más, J.; Aranda, MA; Bendahmane, A. (2007). "EcoTILLING para la identificación de variantes alélicas de melón eIF4E, factor que controla la susceptibilidad al virus". Biología vegetal BMC . 7 : 34. doi : 10.1186/1471-2229-7-34 . PMC 1914064 . PMID 17584936.

[5] Garvin, MR; Gharrett, AJ (2007). "DEco-TILLING: Un método económico para el descubrimiento de polimorfismos de un solo nucleótido que reduce el sesgo de verificación". Notas de ecología molecular . 7 (5): 735–746. doi :10.1111/j.1471-8286.2007.01767.x.

[6] Tsai, Helen; Howell, Tyson; Nitcher, Rebecca; Missirian, Victor; Watson, Brian; Ngo, Kathie J.; Lieberman, Meric; Fass, Joseph; Uauy, Cristobal; Tran, Robert K.; Khan, Asif Ali; Filkov, Vladimir; Tai, Thomas H.; Dubcovsky, Jorge; Comai, Luca (2011). "Descubrimiento de mutaciones raras en poblaciones: TILLING por secuenciación". Fisiología vegetal . 156 (3): 1257–1268. doi :10.1104/pp.110.169748. PMC 3135940 . PMID 21531898.