Centrifugación diferencial

En bioquímica y biología celular , la centrifugación diferencial (también conocida como centrifugación de velocidad diferencial ) es un procedimiento común utilizado para separar orgánulos y otras partículas subcelulares en función de su velocidad de sedimentación . Aunque se aplica con frecuencia en análisis biológicos, la centrifugación diferencial es una técnica general que también resulta adecuada para la purificación de partículas suspendidas no vivas (p. ej. , nanopartículas , partículas coloidales , virus ). En un caso típico en el que se utiliza la centrifugación diferencial para analizar fenómenos biológicos celulares (p. ej., distribución de orgánulos), primero se lisa una muestra de tejido para romper las membranas celulares y liberar los orgánulos y el citosol . A continuación, el lisado se somete a centrifugaciones repetidas , donde las partículas que sedimentan con la suficiente rapidez a una fuerza centrífuga determinada durante un tiempo dado forman un "pellet" compacto en el fondo del tubo de centrifugación. ^{[ 1 ]}

Después de cada centrifugación, el sobrenadante (solución no sedimentada) se retira del tubo y se vuelve a centrifugar con una fuerza centrífuga y/o un tiempo mayores. La centrifugación diferencial es adecuada para separaciones brutas basadas en la velocidad de sedimentación, pero se pueden realizar purificaciones más finas basadas en la densidad mediante centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio . ^{[ 2 ]} Por lo tanto, el método de centrifugación diferencial consiste en la sedimentación sucesiva de partículas del sobrenadante anterior, utilizando fuerzas centrífugas cada vez mayores. ^{[ 3 ]} Los orgánulos celulares separados por centrifugación diferencial mantienen un grado relativamente alto de funcionamiento normal, siempre que no estén sujetos a condiciones desnaturalizantes durante el aislamiento. ^{[ 4 ] [ 5 ]}

En un fluido viscoso, la velocidad de sedimentación de una partícula suspendida determinada (siempre que la partícula sea más densa que el fluido) depende en gran medida de los siguientes factores:

• Fuerza gravitatoria
• Diferencia de densidad
• viscosidad del fluido
• Tamaño y forma de las partículas

Las partículas de mayor tamaño sedimentan más rápidamente y con fuerzas centrífugas menores. Si una partícula es menos densa que el fluido (por ejemplo, grasas en agua), no sedimentará, sino que flotará, independientemente de la fuerza centrífuga que experimente. La fuerza centrífuga separa los componentes no solo en función de la densidad, sino también del tamaño y la forma de las partículas. En cambio, una centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio más especializada produce un perfil de separación que depende únicamente de la densidad de las partículas y, por lo tanto, es adecuada para separaciones de grano más fino.

La elevada fuerza G acelera considerablemente la sedimentación de partículas pequeñas en comparación con la difusión browniana , incluso para partículas muy pequeñas (a escala nanométrica). Cuando se utiliza una centrífuga, la ley de Stokes debe modificarse para tener en cuenta la variación de la fuerza G con la distancia al centro de rotación. ^{[ 6 ]}

${\displaystyle D={\sqrt {\frac {18\eta \,\ln(R_{f}/R_{i})}{(\rho _{p}-\rho _{f})\omega ^{2}t}}}}$

dónde

• D es el diámetro mínimo de las partículas que se espera que sedimenten (m).
• η (o μ) es la viscosidad dinámica del fluido (Pa·s).
• R _{f es el} radio de rotación final (m)
• R _i es el radio de rotación inicial (m)
• ρ _p es la densidad de masa volumétrica de la partícula (kg/m ³ )
• ρ _f es la densidad de masa volumétrica del fluido (kg/m ³ )
• ω es la velocidad angular (radianes/s)
• t es el tiempo necesario para sedimentar desde R i _hasta R _f (s)

La centrifugación diferencial puede utilizarse con partículas intactas (por ejemplo, células biológicas, micropartículas, nanopartículas) o para separar los componentes de una partícula determinada. ^{[ 7 ]} Tomando como ejemplo la separación de orgánulos eucariotas de células intactas, primero se debe lisar y homogeneizar la célula (idealmente mediante una técnica suave, como la homogeneización Dounce ; las técnicas más agresivas o la homogeneización excesiva darán lugar a una menor proporción de orgánulos intactos). Una vez obtenido el extracto crudo de orgánulos, se puede someter a diferentes velocidades de centrifugación para separarlos:

La muestra lisada ya está lista para la centrifugación en una ultracentrífuga . Una ultracentrífuga consta de una cámara refrigerada de baja presión que contiene un rotor accionado por un motor eléctrico capaz de girar a alta velocidad. Las muestras se colocan en tubos dentro del rotor o conectados a él. La velocidad de rotación puede alcanzar hasta 100 000 rpm para el modelo de suelo y 150 000 rpm para el modelo de sobremesa (Beckman Optima Max-XP, Sorvall MTX150 o himac CS150NX), generando fuerzas centrífugas de entre 800 000 g y 1 000 000 g. Esta fuerza provoca la sedimentación de macromoléculas e incluso puede causar distribuciones no uniformes de moléculas pequeñas. ^{[ 8 ]}

Dado que los distintos fragmentos de una célula tienen diferentes tamaños y densidades, cada fragmento se sedimentará en un precipitado con diferentes fuerzas centrífugas mínimas. Por lo tanto, la separación de la muestra en distintas capas se puede realizar centrifugando primero el lisado original con fuerzas débiles, retirando el precipitado y luego exponiendo los sobrenadantes subsiguientes a campos centrífugos progresivamente mayores. En cada ocasión, una porción de diferente densidad se sedimenta en el fondo del recipiente y se extrae, y la aplicación repetida produce una serie de capas que incluyen diferentes partes de la muestra original. Se pueden tomar medidas adicionales para refinar aún más cada uno de los precipitados obtenidos.

La sedimentación depende de la masa, la forma y el volumen específico parcial de una macromolécula, así como de la densidad del disolvente, el tamaño del rotor y la velocidad de rotación. La velocidad de sedimentación se puede monitorizar durante el experimento para calcular el peso molecular . Se pueden calcular los valores del coeficiente de sedimentación (S). Valores altos de S (mayor velocidad de sedimentación) corresponden a un mayor peso molecular. Las partículas densas sedimentan más rápidamente. Las proteínas alargadas tienen coeficientes de fricción mayores y sedimentan más lentamente para garantizar la precisión. ^{[ 9 ]}

La diferencia entre las técnicas de centrifugación diferencial y de gradiente de densidad radica en que esta última utiliza soluciones de diferentes densidades (p. ej. , sacarosa , Ficoll , Percoll ) o geles a través de los cuales pasa la muestra. Esto separa la muestra en capas según su densidad relativa, basándose en el principio de que las moléculas se sedimentan bajo la acción de la fuerza centrífuga hasta alcanzar un medio con la misma densidad. ^{[ 10 ]} El grado de separación o el número de capas depende de la solución o el gel. La centrifugación diferencial, por otro lado, no utiliza un gradiente de densidad y se realiza a velocidades crecientes. Las diferentes velocidades de centrifugación suelen generar una separación en no más de dos fracciones, por lo que el sobrenadante puede separarse aún más en pasos de centrifugación adicionales. Para ello, en cada paso se debe aumentar la velocidad de centrifugación hasta separar las partículas deseadas. En cambio, la centrifugación de gradiente de densidad se realiza generalmente a una sola velocidad de centrifugación. ^{[ 11 ]}

• Ultracentrifugación por densidad de flotación
• Jerome Vinograd
• Svedberg