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Cromatografía iónica

La cromatografía iónica (o cromatografía de intercambio iónico ; abreviada IC o IEC) es una forma de cromatografía que separa iones y moléculas polares ionizables según su afini...

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La cromatografía iónica (o cromatografía de intercambio iónico ; abreviada IC o IEC) es una forma de cromatografía que separa iones y moléculas polares ionizables según su afinidad por el intercambiador iónico. [ 1 ] Funciona con casi cualquier tipo de molécula cargada , incluyendo aniones inorgánicos pequeños , [ 2 ] proteínas grandes , [ 3 ] nucleótidos pequeños [ 4 ] y aminoácidos . Sin embargo, la cromatografía iónica debe realizarse en condiciones que se encuentren a una unidad de pH del punto isoeléctrico de una proteína. [ 5 ]

Los dos tipos de cromatografía iónica son el intercambio aniónico y el intercambio catiónico. La cromatografía de intercambio catiónico se utiliza cuando la molécula de interés tiene carga positiva. La molécula tiene carga positiva porque el pH para la cromatografía es menor que el pI (también conocido como pH(I)). [ 6 ] En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria tiene carga negativa y las moléculas con carga positiva se cargan para ser atraídas hacia ella. La cromatografía de intercambio aniónico se utiliza cuando la fase estacionaria tiene carga positiva y las moléculas con carga negativa (es decir, el pH para la cromatografía es mayor que el pI) se cargan para ser atraídas hacia ella. [ 7 ] Se utiliza frecuentemente en la purificación de proteínas , el análisis de agua, [ 8 ] [ 9 ] y el control de calidad. Las moléculas hidrosolubles y cargadas, como las proteínas, los aminoácidos y los péptidos, se unen a grupos que tienen carga opuesta mediante la formación de enlaces iónicos con la fase estacionaria insoluble. [ 10 ] La fase estacionaria equilibrada consiste en un grupo funcional ionizable donde las moléculas objetivo de una mezcla a separar y cuantificar pueden unirse al pasar a través de la columna; se utiliza una fase estacionaria catiónica para separar aniones y una fase estacionaria aniónica para separar cationes. La cromatografía de intercambio catiónico se utiliza cuando las moléculas que se desean separar son cationes y la cromatografía de intercambio aniónico se utiliza para separar aniones. [ 11 ] Las moléculas unidas luego pueden eluirse y recolectarse utilizando un eluyente que contiene aniones y cationes haciendo pasar una mayor concentración de iones a través de la columna o cambiando el pH de la columna.

Una de las principales ventajas de la cromatografía iónica es que solo interviene una interacción en la separación, a diferencia de otras técnicas; por lo tanto, la cromatografía iónica puede tener una mayor tolerancia a la matriz. Otra ventaja del intercambio iónico es la predictibilidad de los patrones de elución (basada en la presencia del grupo ionizable). [ 12 ] Por ejemplo, cuando se utiliza la cromatografía de intercambio catiónico, ciertos cationes eluyen primero y otros después. Siempre se mantiene un equilibrio de carga local. Sin embargo, también existen desventajas al realizar la cromatografía de intercambio iónico, como la constante evolución de la técnica, que lleva a la inconsistencia entre columnas. [ 13 ] Una limitación importante de esta técnica de purificación es que se limita al grupo ionizable. [ 6 ]

Historia

Cromatografía de intercambio iónico

A partir de 1947, Spedding y Powell utilizaron cromatografía de intercambio iónico por desplazamiento para la separación de los elementos de tierras raras . Además, demostraron la separación por intercambio iónico de los isótopos 14N y 15N en amoníaco . A principios de la década de 1950, Kraus y Nelson demostraron el uso de muchos métodos analíticos para iones metálicos que dependían de la separación de sus complejos de cloruro, fluoruro, nitrato o sulfato mediante cromatografía aniónica. La detección automática en línea se introdujo progresivamente entre 1960 y 1980, así como nuevos métodos cromatográficos para la separación de iones metálicos. Un método innovador de Small, Stevens y Bauman en Dow Chemical Co. dio paso a la creación de la cromatografía iónica moderna. Los aniones y cationes ahora podían separarse eficientemente mediante un sistema de detección de conductividad suprimida . En 1979, Gjerde et al. introdujeron un método para cromatografía aniónica con detección de conductividad no suprimida. Posteriormente, en 1980, se desarrolló un método similar para la cromatografía de cationes. [ 14 ]

Como resultado, se inició un período de competencia extrema en el mercado de IC, con defensores tanto de la detección de conductividad suprimida como no suprimida. Esta competencia propició el rápido crecimiento de nuevas formas y la rápida evolución de IC. [ 15 ] Un desafío que debe superarse en el futuro desarrollo de IC es la preparación de columnas monolíticas de intercambio iónico de alta eficiencia, y superar este desafío sería de gran importancia para el desarrollo de IC. [ 16 ]

El auge de la cromatografía de intercambio iónico comenzó principalmente entre 1935 y 1950 durante la Segunda Guerra Mundial , y sus aplicaciones se extendieron significativamente gracias al Proyecto Manhattan . La cromatografía iónica fue introducida originalmente por dos investigadores ingleses: el agrónomo Sir Thompson y el químico J.T. Way. Los trabajos de Thompson y Way se centraron en la acción de sales fertilizantes solubles en agua, sulfato de amonio y cloruro de potasio . Estas sales no se podían extraer fácilmente del suelo debido a la lluvia. Emplearon métodos iónicos para tratar arcillas con estas sales, lo que resultó en la extracción de amoníaco, además de la liberación de calcio . [ 17 ] En las décadas de 1950 y 1960, se desarrollaron modelos teóricos para la cromatografía de intercambio iónico con el fin de comprenderla mejor, y en la década de 1970 se utilizaron detectores continuos, allanando el camino para el desarrollo de la cromatografía de baja presión a la de alto rendimiento. En 1975, se estableció el término "cromatografía iónica" como referencia a las técnicas, y posteriormente se utilizó con fines comerciales. Actualmente, la cromatografía iónica (CI) es importante para investigar sistemas acuosos, como el agua potable. Es un método popular para analizar elementos o complejos aniónicos que ayudan a resolver problemas ambientales relevantes. Asimismo, tiene grandes aplicaciones en la industria de los semiconductores . [ 18 ]

Debido a la abundancia de columnas de separación, sistemas de elución y detectores disponibles, la cromatografía se ha convertido en el principal método para el análisis de iones. [ 19 ]

Cuando se desarrolló inicialmente esta técnica, se utilizaba principalmente para el tratamiento de agua. Desde 1935, la cromatografía de intercambio iónico se convirtió rápidamente en una de las técnicas más utilizadas, y sus principios se aplican con frecuencia a la mayoría de los campos de la química, incluyendo la destilación , la adsorción y la filtración . [ 20 ]

Principio

Cromatograma iónico que muestra la separación de aniones.

La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas en función de sus respectivos grupos cargados. Retiene las moléculas del analito en la columna mediante interacciones coulombianas (iónicas). La matriz de la cromatografía de intercambio iónico está compuesta por iones con carga positiva y negativa. [ 21 ] Esencialmente, las moléculas experimentan interacciones electrostáticas con cargas opuestas en la matriz de la fase estacionaria. La fase estacionaria consiste en una matriz inmóvil que contiene grupos funcionales ionizables cargados o ligandos . [ 22 ] La superficie de la fase estacionaria presenta grupos funcionales iónicos (RX) que interactúan con los iones del analito de carga opuesta. Para lograr la electroneutralidad, estas cargas inmovilizadas se acoplan con contraiones intercambiables en la solución. Las moléculas ionizables que se van a purificar compiten con estos contraiones intercambiables por la unión a las cargas inmovilizadas en la fase estacionaria. Estas moléculas ionizables se retienen o eluyen según su carga. Inicialmente, las moléculas que no se unen o se unen débilmente a la fase estacionaria se eliminan primero mediante lavado. Se necesitan condiciones alteradas para la elución de las moléculas que se unen a la fase estacionaria. Se puede aumentar la concentración de los contraiones intercambiables, que compiten con las moléculas por la unión, o cambiar el pH para afectar la carga iónica del eluyente o del soluto. Un cambio en el pH afecta la carga de las moléculas particulares y, por lo tanto, altera su unión. Al reducir la carga neta de las moléculas del soluto, estas comienzan a eluir. De esta manera, tales ajustes se pueden usar para liberar las proteínas de interés. Además, la concentración de contraiones se puede variar gradualmente para afectar la retención de las moléculas ionizadas, separándolas así. Este tipo de elución se llama elución por gradiente. Por otro lado, se puede usar la elución por etapas, en la que la concentración de contraiones se varía en etapas. [ 5 ] Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico . Las moléculas con carga positiva se unen a las resinas de intercambio catiónico, mientras que las moléculas con carga negativa se unen a las resinas de intercambio aniónico. [ 23 ] El compuesto iónico formado por la especie catiónica M+ y la especie aniónica B− puede ser retenido por la fase estacionaria.

La cromatografía de intercambio catiónico retiene los cationes con carga positiva porque la fase estacionaria presenta un grupo funcional con carga negativa:

RX−do++METRO+B−⇄RX−METRO++do++B−{\displaystyle {\text{RX}}^{-}{\text{C}}^{+}\,+\,{\text{M}}^{+}\,{\text{B}}^{-}\rightleftarrows \,{\text{RX}}^{-}{\text{M}}^{+}\,+\,{\text{C}}^{+}\,+\,{\text{B}}^{-}}

La cromatografía de intercambio aniónico retiene los aniones mediante grupos funcionales con carga positiva:

RX+A−+METRO+B−⇄RX+B−+METRO++A−{\displaystyle {\text{RX}}^{+}{\text{A}}^{-}\,+\,{\text{M}}^{+}\,{\text{B}}^{-}\rightleftarrows \,{\text{RX}}^{+}{\text{B}}^{-}\,+\,{\text{M}}^{+}\,+\,{\text{A}}^{-}}

Cabe señalar que la fuerza iónica de C+ o A− en la fase móvil se puede ajustar para modificar la posición de equilibrio y, por lo tanto, el tiempo de retención.

El cromatograma iónico muestra un cromatograma típico obtenido con una columna de intercambio aniónico.

Procedimiento

Antes de iniciar la cromatografía de intercambio iónico, es necesario equilibrar la fase estacionaria. Esta debe equilibrarse según ciertos requisitos que dependen del experimento. Una vez equilibrada, los iones cargados en la fase estacionaria se unirán a sus iones intercambiables de carga opuesta, como Cl⁻ o Na⁺ . A continuación, se debe seleccionar un tampón al que pueda unirse la proteína deseada. Tras el equilibrio, se lava la columna. El lavado ayuda a eluir las impurezas que no se unen a la matriz, mientras que la proteína de interés permanece unida. Este tampón de muestra debe tener el mismo pH que el tampón utilizado para el equilibrio, lo que facilita la unión de las proteínas deseadas. Las proteínas sin carga se eluyen de la columna a una velocidad similar a la del tampón, sin retención. Una vez cargada la muestra en la columna y lavada con el tampón para eluir las proteínas no deseadas, se realiza la elución en condiciones específicas para eluir las proteínas deseadas unidas a la matriz. Las proteínas unidas se eluyen mediante un gradiente de concentración de sal que aumenta linealmente. Al aumentar la fuerza iónica del tampón, los iones de sal compiten con las proteínas deseadas para unirse a los grupos cargados en la superficie del medio. Esto provoca que las proteínas deseadas se eluyan de la columna. Las proteínas con una carga neta baja se eluyen primero a medida que aumenta la concentración de sal, lo que incrementa la fuerza iónica. Las proteínas con una carga neta alta requieren una mayor fuerza iónica para su elución. [ 21 ]

Es posible realizar cromatografía de intercambio iónico en masa, en capas delgadas de soportes como placas de vidrio o plástico recubiertas con la fase estacionaria deseada, o en columnas cromatográficas. La cromatografía de capa fina y la cromatografía de columna comparten similitudes, ya que ambas se rigen por los mismos principios: un intercambio constante y frecuente de moléculas a medida que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria. No es imprescindible añadir la muestra en volúmenes minúsculos, puesto que las condiciones predeterminadas para la columna de intercambio se han elegido para que exista una fuerte interacción entre las fases móvil y estacionaria. Además, el mecanismo del proceso de elución provoca la compartimentación de las diferentes moléculas en función de sus características químicas. Este fenómeno se debe a un aumento de la concentración de sal en la parte superior de la columna o cerca de ella, lo que desplaza las moléculas en esa posición, mientras que las moléculas unidas a la parte inferior se liberan posteriormente cuando la mayor concentración de sal alcanza esa zona. Estos principios son las razones por las que la cromatografía de intercambio iónico es una excelente candidata para las etapas iniciales de cromatografía en un procedimiento de purificación complejo, ya que puede producir rápidamente pequeños volúmenes de moléculas objetivo independientemente de un mayor volumen inicial. [ 6 ]

La cámara (izquierda) contiene una alta concentración de sal. La cámara agitada (derecha) contiene una baja concentración de sal. La agitación gradual provoca la formación de un gradiente de sal a medida que la sal se desplaza de concentraciones altas a bajas.

A menudo se utilizan dispositivos relativamente sencillos para aplicar contraiones con un gradiente creciente a una columna de cromatografía. Los contraiones como el cobre (II) se eligen con mayor frecuencia para separar eficazmente péptidos y aminoácidos mediante la formación de complejos. [ 24 ]

Se puede utilizar un dispositivo sencillo para crear un gradiente de sal. El tampón de elución se introduce continuamente en la cámara de mezcla, modificando así su concentración. Generalmente, el tampón de la cámara de mezcla tiene una concentración inicial alta, mientras que el de la cámara de agitación suele tener una concentración baja. A medida que el tampón de alta concentración de la cámara izquierda se mezcla y se introduce en la columna, la concentración de tampón en la columna de agitación aumenta gradualmente. Modificar la forma de la cámara de agitación, así como la del tampón límite, permite generar gradientes de contraiones cóncavos, lineales o convexos.

Se utiliza una multitud de medios diferentes para la fase estacionaria. Entre los grupos cargados inmovilizados más comunes se encuentran el trimetilaminoetilo (TAM), el trietilaminoetilo (TEAE), el dietil-2-hidroxipropilaminoetilo (QAE), el aminoetilo (AE), el dietilaminoetilo (DEAE), el sulfo (S), el sulfometilo (SM), el sulfopropilo (SP), el carboxilo (C) y el carboximetilo (CM). [ 5 ]

El correcto empaquetamiento de la columna es un aspecto importante de la cromatografía iónica. La estabilidad y la eficiencia de la columna final dependen de los métodos de empaquetamiento, el disolvente utilizado y los factores que afectan a sus propiedades mecánicas. A diferencia de los primeros métodos de empaquetamiento en seco, que resultaban ineficientes, el empaquetamiento en suspensión húmeda, en el que las partículas suspendidas en un disolvente adecuado se introducen en la columna a presión, muestra una mejora significativa. Se pueden emplear tres enfoques diferentes para realizar el empaquetamiento en suspensión húmeda: el método de densidad equilibrada (la densidad del disolvente es similar a la de las partículas de sílice porosa), el método de alta viscosidad (se utiliza un disolvente de alta viscosidad) y el método de suspensión de baja viscosidad (realizado con disolventes de baja viscosidad). [ 25 ]

El poliestireno se utiliza como medio para el intercambio iónico. Se obtiene mediante la polimerización de estireno con divinilbenceno y peróxido de benzoilo . Estos intercambiadores forman interacciones hidrofóbicas con las proteínas que pueden ser irreversibles. Debido a esta propiedad, los intercambiadores iónicos de poliestireno no son adecuados para la separación de proteínas. Sin embargo, se utilizan para la separación de moléculas pequeñas en la separación de aminoácidos y la eliminación de sales del agua. Los intercambiadores iónicos de poliestireno con poros grandes pueden utilizarse para la separación de proteínas, pero deben recubrirse con una sustancia hidrofílica. [ 26 ]

Los medios a base de celulosa pueden utilizarse para la separación de moléculas grandes debido a que contienen poros grandes. La unión de proteínas en este medio es alta y tiene un bajo carácter hidrofóbico. El DEAE es una matriz de intercambio aniónico que se produce a partir de un grupo lateral positivo de dietilaminoetilo unido a celulosa o Sephadex . [ 27 ]

Los medios a base de gel de agarosa también contienen poros grandes, pero su capacidad de sustitución es menor en comparación con los dextranos . La capacidad del medio para hincharse en líquido depende de la reticulación de estas sustancias, el pH y las concentraciones iónicas de los tampones utilizados. [ 26 ]

La incorporación de alta temperatura y presión permite un aumento significativo en la eficiencia de la cromatografía iónica, junto con una disminución del tiempo. La temperatura influye en la selectividad debido a sus efectos sobre las propiedades de retención. El factor de retención ( k = ( t R g − t M g )/( t M g − t ext )) aumenta con la temperatura para iones pequeños, y se observa la tendencia opuesta para iones más grandes. [ 28 ] [ 29 ]

A pesar de la selectividad iónica en diferentes medios, se están realizando más investigaciones para llevar a cabo la cromatografía de intercambio iónico en el rango de 40–175  °C. [ 30 ]

Se puede seleccionar un disolvente adecuado basándose en las observaciones del comportamiento de las partículas de la columna en dicho disolvente. Mediante un microscopio óptico, se puede distinguir fácilmente un estado de dispersión deseable de la suspensión de partículas agregadas. [ 25 ]

Intercambiadores de iones débiles y fuertes

Un intercambiador iónico "fuerte" no pierde la carga en su matriz una vez que la columna se equilibra, por lo que se puede utilizar un amplio rango de tampones de pH. Los intercambiadores iónicos "débiles" tienen un rango de valores de pH en el que mantienen su carga. Si el pH del tampón utilizado para una columna de intercambio iónico débil sale del rango de capacidad de la matriz, la columna perderá su distribución de carga y la molécula de interés puede perderse. [ 31 ] A pesar del menor rango de pH de los intercambiadores iónicos débiles, a menudo se utilizan en lugar de los intercambiadores iónicos fuertes debido a su mayor especificidad. En algunos experimentos, los tiempos de retención de los intercambiadores iónicos débiles son lo suficientemente largos como para obtener los datos deseados con alta especificidad. [ 32 ]

Las resinas (a menudo denominadas "perlas") de las columnas de intercambio iónico pueden incluir grupos funcionales como ácidos débiles/fuertes y bases débiles/fuertes. También hay columnas especiales que tienen resinas con grupos funcionales anfóteros que pueden intercambiar tanto cationes como aniones. [ 33 ] Algunos ejemplos de grupos funcionales de resinas de intercambio iónico fuertes son el catión de amonio cuaternario (Q), que es un intercambiador de aniones, y el ácido sulfónico (S, -SO 2 OH), que es un intercambiador de cationes. [ 34 ] Este tipo de intercambiadores pueden mantener su densidad de carga en un rango de pH de 0 a 14. Ejemplos de grupos funcionales de resinas de intercambio iónico débiles incluyen dietilaminoetilo (DEAE, -C 2 H 4 N(C 2 H 5 ) 2 ), que es un intercambiador de aniones, y carboximetilo (CM, -CH 2 -COOH), [ 35 ] que es un intercambiador de cationes. Estos dos tipos de intercambiadores pueden mantener la densidad de carga de sus columnas en un rango de pH de 5 a 9.

En cromatografía iónica, la interacción de los iones del soluto con la fase estacionaria, en función de sus cargas, determina qué iones se unirán y en qué medida. Cuando la fase estacionaria presenta grupos positivos que atraen aniones, se denomina intercambiador aniónico; cuando presenta grupos negativos, atrae cationes y se denomina intercambiador catiónico. [ 36 ] La atracción entre los iones y la fase estacionaria también depende de la resina y las partículas orgánicas utilizadas como intercambiadores iónicos.

Cada resina presenta una selectividad relativa que varía según los iones soluto presentes que competirán por unirse al grupo de resina en la fase estacionaria. El coeficiente de selectividad, equivalente a la constante de equilibrio , se determina mediante una relación de las concentraciones entre la resina y cada ion; sin embargo, la tendencia general es que los intercambiadores iónicos prefieren unirse al ion con una carga mayor, un radio hidratado menor y una polarizabilidad mayor, o la capacidad de que la nube electrónica de un ion sea perturbada por otras cargas. [ 37 ] A pesar de esta selectividad, cantidades excesivas de un ion con una selectividad menor introducidas en la columna harían que el ion menos selectivo se uniera más a la fase estacionaria, ya que el coeficiente de selectividad permite fluctuaciones en la reacción de unión que tiene lugar durante la cromatografía de intercambio iónico.

La siguiente tabla muestra los intercambiadores de iones de uso común. [ 38 ]

Técnica típica

Se introduce una muestra, ya sea manualmente o con un automuestreador , en un bucle de muestra de volumen conocido. Una solución acuosa tamponada , denominada fase móvil, transporta la muestra desde el bucle hasta una columna que contiene algún tipo de material de fase estacionaria. Este material suele ser una matriz de resina o gel compuesta por perlas de agarosa o celulosa con grupos funcionales cargados unidos covalentemente . Es necesario equilibrar la fase estacionaria para obtener la carga deseada de la columna. Si la columna no está correctamente equilibrada, la molécula deseada podría no unirse con fuerza a ella. Los analitos de interés (aniones o cationes) se retienen en la fase estacionaria, pero pueden eluirse aumentando la concentración de una especie con carga similar que desplace los iones analito de la fase estacionaria. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio catiónico, el analito con carga positiva puede desplazarse añadiendo iones sodio con carga positiva. Los analitos de interés deben detectarse mediante algún método, normalmente conductividad o absorbancia de luz UV /visible.

El control de un sistema IC generalmente requiere un sistema de datos de cromatografía (CDS). Además de los sistemas IC, algunos de estos CDS también pueden controlar la cromatografía de gases (GC) y la HPLC.

Cromatografía de intercambio de membrana

Un tipo de cromatografía de intercambio iónico, el intercambio de membrana [ 39 ] [ 40 ] es un método de purificación relativamente nuevo diseñado para superar las limitaciones del uso de columnas rellenas de perlas. Los dispositivos de cromatografía de membrana [ 41 ] [ 42 ] son ​​económicos de producir en masa y desechables, a diferencia de otros dispositivos de cromatografía que requieren mantenimiento y tiempo para su revalidación. Existen tres tipos de absorbentes de membrana que se utilizan habitualmente para la separación de sustancias: lámina plana, fibra hueca y flujo radial. El absorbente más común y más adecuado para la cromatografía de membrana son las láminas planas múltiples, ya que poseen un mayor volumen absorbente. Se puede utilizar para superar las limitaciones de transferencia de masa [ 43 ] y la caída de presión [ 44 ] , lo que lo hace especialmente útil para aislar y purificar virus , ADN plasmídico y otras macromoléculas grandes . La columna está rellena de membranas microporosas con poros internos que contienen grupos adsorbentes que pueden unirse a la proteína objetivo. Las membranas adsorbentes están disponibles en diversas geometrías y composiciones químicas, lo que permite su uso para purificación, fraccionamiento, concentración y clarificación con una eficiencia diez veces mayor que la del uso de microesferas. [ 45 ] Las membranas pueden prepararse mediante el aislamiento de la propia membrana, la cual se corta en cuadrados y se inmoviliza. Un método más reciente implica el uso de células vivas adheridas a una membrana de soporte, las cuales se utilizan para la identificación y clarificación de moléculas de señalización. [ 46 ]

Separación de proteínas

Columna de intercambio iónico a escala preparativa utilizada para la purificación de proteínas.

La cromatografía de intercambio iónico se puede utilizar para separar proteínas debido a que contienen grupos funcionales cargados. Los iones de interés (en este caso, proteínas cargadas) se intercambian por otros iones (generalmente H + ) en un soporte sólido cargado. Los solutos suelen estar en una fase líquida, que tiende a ser agua. Tomemos como ejemplo las proteínas en agua, que constituirían una fase líquida que se hace pasar a través de una columna. La columna se conoce comúnmente como fase sólida, ya que está llena de partículas sintéticas porosas con una carga específica. Estas partículas porosas, también llamadas perlas, pueden estar aminadas (contener grupos amino) o tener iones metálicos para conferirles carga. La columna se puede preparar utilizando polímeros porosos; para macromoléculas con una masa superior a 100  000  Da, el tamaño óptimo de la partícula porosa es de aproximadamente 1 μm²  . Esto se debe a que la lenta difusión de los solutos dentro de los poros no limita la calidad de la separación. [ 47 ] Las perlas que contienen grupos con carga positiva, que atraen las proteínas con carga negativa, se denominan comúnmente resinas de intercambio aniónico. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales con carga negativa a pH 7 (pH del agua) son el glutamato y el aspartato. Las perlas con carga negativa se denominan resinas de intercambio catiónico, ya que atraen las proteínas con carga positiva. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales con carga positiva a pH 7 son la lisina, la histidina y la arginina . [ 48 ]  

El punto isoeléctrico es el pH en el que un compuesto —en este caso, una proteína— no tiene carga neta. El punto isoeléctrico (PI) de una proteína se puede determinar utilizando el pKa de las cadenas laterales; si la cadena amino (positiva) puede neutralizar la cadena carboxilo (negativa), la proteína estaría en su PI.  Es recomendable usar tampones en lugar de agua para proteínas que no tienen carga a pH 7, ya que permite manipular el pH para alterar las interacciones iónicas entre las proteínas y las microesferas. [ 49 ] Las cadenas laterales débilmente ácidas o básicas pueden tener carga si el pH es suficientemente alto o bajo, respectivamente. La separación se puede lograr en función del punto isoeléctrico natural de la proteína. Alternativamente, se puede agregar genéticamente una etiqueta peptídica a la proteína para darle un punto isoeléctrico distinto al de la mayoría de las proteínas naturales (por ejemplo, 6 argininas para la unión a una resina de intercambio catiónico o 6 glutamatos para la unión a una resina de intercambio aniónico como DEAE-Sepharose).

La elución mediante el aumento de la fuerza iónica de la fase móvil es un proceso más sutil. Funciona porque los iones de la fase móvil interactúan con los iones inmovilizados en la fase estacionaria, protegiendo así la fase estacionaria de la proteína y permitiendo que esta eluya.

La elución de columnas de intercambio iónico puede ser sensible a cambios de una sola carga ( cromatofocalización ). La cromatografía de intercambio iónico también es útil en el aislamiento de ensamblajes proteicos multiméricos específicos, lo que permite la purificación de complejos específicos según el número y la posición de las etiquetas peptídicas cargadas. [ 50 ] [ 51 ]

Efecto Gibbs-Donnan

En la cromatografía de intercambio iónico, el efecto Gibbs-Donnan se observa cuando el pH del tampón aplicado y el del intercambiador iónico difieren, incluso hasta en una unidad de pH. Por ejemplo, en las columnas de intercambio aniónico, los intercambiadores iónicos repelen protones, por lo que el pH del tampón cerca de la columna difiere y es mayor que el del resto del disolvente. [ 52 ] En consecuencia, el experimentador debe asegurarse de que la(s) proteína(s) de interés sea(n) estable(s) y esté(n) cargada(s) correctamente en el pH "real".

Este efecto se produce como resultado de que dos partículas con carga similar, una de la resina y otra de la solución, no se distribuyen adecuadamente entre ambos lados; se produce una captación selectiva de un ion sobre otro. [ 53 ] [ 54 ] Por ejemplo, en una resina de poliestireno sulfonado, una resina de intercambio catiónico, el ion cloruro de un tampón de ácido clorhídrico debería equilibrarse en la resina. Sin embargo, dado que la concentración del ácido sulfónico en la resina es alta, el hidrógeno del HCl no tiende a entrar en la columna. Esto, combinado con la necesidad de electroneutralidad, da lugar a una cantidad mínima de hidrógeno y cloro que entra en la resina. [ 54 ]

Usos

Utilidad clínica

Una aplicación de la cromatografía iónica se observa en la cromatografía de argentación . Generalmente, la plata y los compuestos que contienen enlaces acetilénicos y etilénicos presentan interacciones muy débiles. Este fenómeno se ha estudiado ampliamente en compuestos olefínicos. Los complejos iónicos que forman las olefinas con los iones de plata son débiles y se basan en la superposición de orbitales pi, sigma y d, y los electrones disponibles, por lo que no provocan cambios significativos en el doble enlace. Este comportamiento se aprovechó para separar lípidos, principalmente ácidos grasos, de mezclas en fracciones con diferente número de dobles enlaces mediante iones de plata. Las resinas iónicas se impregnaron con iones de plata y posteriormente se expusieron a diversos ácidos (ácido silícico) para eluir ácidos grasos de diferentes características.

Se pueden obtener límites de detección tan bajos como 1 μM para iones de metales alcalinos . [ 55 ] Puede utilizarse para la medición de HbA1c , porfirina y con purificación de agua . Las resinas de intercambio iónico (RII) se han utilizado ampliamente, especialmente en medicina, debido a su alta capacidad y al sistema sencillo del proceso de separación. Uno de los usos sintéticos es el uso de resinas de intercambio iónico para la diálisis renal. Este método se utiliza para separar los elementos sanguíneos mediante un riñón artificial con membrana de celulosa. [ 56 ]

Otra aplicación clínica de la cromatografía iónica es la técnica de cromatografía de intercambio aniónico rápido utilizada para separar las isoenzimas de la creatina quinasa (CK) del suero humano y del tejido obtenido en material de autopsia (principalmente se utilizaron tejidos ricos en CK como el músculo cardíaco y el cerebro). Estas isoenzimas incluyen MM, MB y BB, que realizan la misma función a pesar de tener diferentes secuencias de aminoácidos. Las funciones de estas isoenzimas son convertir la creatina, utilizando ATP, en fosfocreatina expulsando ADP. Se llenaron minicolumnas con DEAE-Sephadex A-50 y posteriormente se eluyeron con tampón Tris-cloruro de sodio a varias concentraciones (cada concentración se eligió ventajosamente para manipular la elución). Se insertó extracto de tejido humano en las columnas para su separación. Se analizaron todas las fracciones para ver la actividad total de CK y se encontró que cada fuente de isoenzimas de CK tenía isoenzimas características. Primero se eluyó CK-MM, luego CK-MB, seguido de CK-BB. Por lo tanto, las isoenzimas encontradas en cada muestra podrían utilizarse para identificar la fuente, ya que eran específicas del tejido.

Utilizando la información de los resultados, se pudo establecer una correlación entre el diagnóstico de los pacientes y el tipo de isoenzimas CK presentes en mayor actividad. Según los hallazgos, aproximadamente 35 de los 71 pacientes estudiados que sufrieron un infarto de miocardio también presentaban una cantidad abundante de las isoenzimas CK-MM y CK-MB. Los resultados muestran además que muchos otros diagnósticos, como insuficiencia renal, enfermedad cerebrovascular y enfermedad pulmonar, solo presentaban la isoenzima CK-MM y ninguna otra. Los resultados de este estudio indican correlaciones entre diversas enfermedades y las isoenzimas CK encontradas, lo que confirma los resultados de pruebas previas realizadas con diversas técnicas. Los estudios sobre la CK-MB en víctimas de infarto de miocardio se han ampliado desde este estudio y la aplicación de la cromatografía iónica.

Aplicaciones industriales

Desde 1975, la cromatografía iónica se ha utilizado ampliamente en muchas ramas de la industria. Las principales ventajas son la fiabilidad, muy buena exactitud y precisión, alta selectividad, alta velocidad, alta eficiencia de separación y bajo costo de consumibles. El desarrollo más significativo relacionado con la cromatografía iónica son los nuevos métodos de preparación de muestras; la mejora de la velocidad y selectividad de la separación de analitos; la reducción de los límites de detección y los límites de cuantificación; la ampliación del alcance de las aplicaciones; el desarrollo de nuevos métodos estándar; la miniaturización y la ampliación del alcance del análisis de un nuevo grupo de sustancias. Permite la prueba cuantitativa de electrolitos y aditivos patentados de baños de galvanoplastia . [ 57 ] Es un avance de la prueba cualitativa de celda de Hull o la prueba UV menos precisa. Se pueden medir iones, catalizadores, abrillantadores y aceleradores. [ 57 ] La cromatografía de intercambio iónico se ha convertido gradualmente en una técnica universal ampliamente conocida para la detección de especies tanto aniónicas como catiónicas. Se han desarrollado o están en desarrollo aplicaciones para estos fines en diversos campos de interés, en particular en la industria farmacéutica. El uso de la cromatografía de intercambio iónico en productos farmacéuticos ha aumentado en los últimos años, y en 2006 se añadió oficialmente un capítulo sobre cromatografía de intercambio iónico a la Farmacopea de los Estados Unidos - Formulario Nacional (USP-NF). Además, en la edición de 2009 de la USP-NF, la Farmacopea de los Estados Unidos puso a disposición varios análisis de cromatografía iónica mediante dos técnicas: detección por conductividad y detección amperométrica pulsada . La mayoría de estas aplicaciones se utilizan principalmente para medir y analizar los límites residuales en productos farmacéuticos, incluyendo la detección de los límites de oxalato, yoduro, sulfato, sulfamato, fosfato, así como diversos electrolitos como el potasio y el sodio. En total, la edición de 2009 de la USP-NF publicó oficialmente veintiocho métodos de detección para el análisis de compuestos activos o componentes de compuestos activos, utilizando detección por conductividad o detección amperométrica pulsada. [ 58 ]

Desarrollo de fármacos

Un sistema de cromatografía iónica utilizado para detectar y medir cationes como sodio, amonio y potasio en formulaciones expectorantes para la tos.

Ha habido un creciente interés en la aplicación de la cromatografía iónica en el análisis de fármacos . La cromatografía iónica se utiliza en diferentes aspectos del desarrollo de productos y las pruebas de control de calidad . Por ejemplo, se utiliza para mejorar la estabilidad y las propiedades de solubilidad de las moléculas de fármacos activos, así como para detectar sistemas con mayor tolerancia a los disolventes orgánicos. La cromatografía iónica se ha utilizado para la determinación de analitos como parte de una prueba de disolución. Por ejemplo, las pruebas de disolución de calcio han demostrado que otros iones presentes en el medio pueden resolverse bien entre sí y también del ion calcio. Por lo tanto, la cromatografía iónica se ha empleado en fármacos en forma de comprimidos y cápsulas para determinar la cantidad de fármaco disuelto con el tiempo. [ 59 ] La cromatografía iónica también se utiliza ampliamente para la detección y cuantificación de excipientes o ingredientes inactivos utilizados en formulaciones farmacéuticas. La detección de azúcares y alcoholes de azúcar en dichas formulaciones mediante cromatografía iónica se ha realizado debido a que estos grupos polares se resuelven en la columna iónica. La metodología de cromatografía iónica también se ha establecido en el análisis de impurezas en sustancias y productos farmacéuticos. Se evalúan las impurezas o cualquier componente que no forme parte de la entidad química del fármaco, lo que proporciona información sobre las cantidades máximas y mínimas de medicamento que se deben administrar a un paciente por día. [ 60 ]

Véase también

Referencias

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