caseína K

La quimosina (EC 3.4.23.4) es una proteasa aspártica que hidroliza específicamente el enlace peptídico en Phe105-Met106 de la κ-caseína y se considera la proteasa más eficiente para la industria quesera . ^{[ 17 ]} Sin embargo, hay proteasas de coagulación de la leche capaces de escindir otros enlaces peptídicos en la cadena de κ-caseína, como la endotiapepsina producida por Endothia parasitica . ^{[ 18 ]} También hay varias proteasas de coagulación de la leche que, al ser capaces de escindir el enlace Phe105-Met106 en la molécula de κ-caseína, también escinden otros enlaces peptídicos en otras caseínas, como las producidas por Cynara cardunculus ^{[ 12 ] [ 19 ] [ 20 ]} o incluso la quimosina bovina. ^{[ 21 ]} Esto permite la fabricación de diferentes quesos con una variedad de propiedades reológicas y organolépticas .

El proceso de coagulación de la leche consta de tres fases principales: ^{[ 22 ]}

1. Degradación enzimática de la κ-caseína.
2. Floculación micelar .
3. Formación de gel.

Cada paso sigue un patrón cinético diferente , siendo el paso limitante en la coagulación de la leche la tasa de degradación de la κ-caseína. El patrón cinético del segundo paso del proceso de coagulación de la leche está influenciado por la naturaleza cooperativa de la floculación micelar, ^{[ 23 ] [ 20 ]} mientras que las propiedades reológicas del gel formado dependen del tipo de acción de las proteasas, el tipo de leche y los patrones de proteólisis de la caseína. ^{[ 20 ]} El proceso general está influenciado por varios factores diferentes, como el pH o la temperatura. ^{[ 19 ] [ 16 ]}

La forma convencional de cuantificar una enzima de coagulación de la leche ^{[ 24 ]} emplea la leche como sustrato y determina el tiempo transcurrido antes de la aparición de coágulos. Sin embargo, la coagulación de la leche puede ocurrir sin la participación de enzimas debido a variaciones en factores fisicoquímicos, como un pH bajo o una temperatura alta. ^{[ 12 ] [ 9 ] [ 16 ]} En consecuencia, esto puede llevar a resultados confusos e irreproducibles, particularmente cuando las enzimas tienen baja actividad. Al mismo tiempo, el método clásico no es suficientemente específico, en términos de establecer el inicio preciso de la gelificación de la leche, por lo que la determinación de las unidades enzimáticas involucradas se vuelve difícil y poco clara. Además, aunque se ha informado que la hidrólisis de la κ-caseína sigue la cinética típica de Michaelis-Menten , ^{[ 22 ]} es difícil de determinar con el ensayo clásico de coagulación de la leche.

Para superar esto, se han propuesto varios métodos alternativos, como la determinación del diámetro del halo en leche gelificada con agar, ^{[ 24 ]} la medición colorimétrica, ^{[ 25 ]} o la determinación de la tasa de degradación de la caseína previamente marcada con un trazador radiactivo ^{[ 26 ]} o un compuesto fluorocromo . ^{[ 27 ]} Todos estos métodos utilizan la caseína como sustrato para cuantificar las actividades proteolíticas o de coagulación de la leche.

La κ-caseína se marca con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína ( FITC ) para obtener el derivado tiocarbamoilo de fluoresceína ( FTC ). Este sustrato se utiliza para determinar la actividad coagulante de la leche de las proteasas. ^{[ 28 ]}

El método FTC-κ-caseína permite determinar con exactitud la degradación de la κ-caseína, el primer paso en el proceso de coagulación de la leche. Este método es el resultado de una modificación del descrito por SS Twining (1984). La principal modificación consistió en sustituir el sustrato previamente utilizado ( caseína ) por κ-caseína marcada con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC) para obtener el derivado tiocarbamoilo de fluoresceína (FTC). Esta variación permite cuantificar las moléculas de κ-caseína degradadas de forma más precisa y específica, detectando únicamente las enzimas capaces de degradar dichas moléculas. El método descrito por Twining (1984), sin embargo, fue diseñado para detectar la actividad proteolítica de una variedad considerablemente mayor de enzimas. El método FTC-κ-caseína permite la detección de diferentes tipos de proteasas en niveles en los que aún no se observa coagulación de la leche, demostrando su mayor sensibilidad en comparación con los procedimientos de ensayo utilizados actualmente. Por lo tanto, este método podría aplicarse como indicador durante la purificación o caracterización de nuevas enzimas coagulantes de la leche.