Ratón knockout

Un ratón knockout , o ratón transgénico , es un ratón genéticamente modificado ( Mus musculus ) en el que los investigadores han inactivado, o " eliminado ", un gen existente reemplazándolo o alterándolo con un fragmento artificial de ADN . Son modelos animales importantes para estudiar la función de genes que han sido secuenciados pero cuyas funciones aún no se han determinado. Al inactivar un gen específico en el ratón y observar cualquier diferencia con respecto al comportamiento o la fisiología normales, los investigadores pueden inferir su probable función.

Actualmente, los ratones son la especie animal de laboratorio más emparentada con los humanos en la que se puede aplicar fácilmente la técnica de eliminación génica. Se utilizan ampliamente en experimentos de eliminación génica, especialmente en aquellos que investigan cuestiones genéticas relacionadas con la fisiología humana . La eliminación génica en ratas es mucho más difícil y solo ha sido posible desde 2003. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

El primer ratón transgénico del que se tiene constancia fue creado por Mario R. Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies en 1989, por lo que recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2007. Diversos aspectos de la tecnología para generar ratones transgénicos, así como los propios ratones, han sido patentados en numerosos países por empresas privadas.

La inactivación de un gen proporciona información sobre su función habitual. Los humanos compartimos muchos genes con los ratones. Por consiguiente, la observación de las características de los ratones modificados genéticamente ofrece a los investigadores información útil para comprender mejor cómo un gen similar puede causar o contribuir a enfermedades en humanos.

Entre los ejemplos de investigación en los que los ratones transgénicos han resultado útiles se incluyen el estudio y la modelización de diferentes tipos de cáncer , obesidad , enfermedades cardíacas , diabetes , artritis , abuso de sustancias , ansiedad , envejecimiento y enfermedad de Parkinson . Los ratones transgénicos también ofrecen un contexto biológico y científico en el que se pueden desarrollar y probar fármacos y otras terapias.

Millones de ratones modificados genéticamente se utilizan en experimentos cada año. ^{[ 3 ]}

Existen miles de cepas diferentes de ratones knockout. ^{[ 3 ]} Muchos modelos de ratón reciben su nombre del gen que ha sido inactivado. Por ejemplo, el ratón knockout p53 recibe su nombre del gen p53, que codifica una proteína que normalmente suprime el crecimiento de tumores al detener la división celular y/o inducir la apoptosis. Los humanos que nacen con mutaciones que desactivan el gen p53 tienen el síndrome de Li-Fraumeni , una afección que aumenta drásticamente el riesgo de desarrollar cáncer de hueso, cáncer de mama y cáncer de sangre a una edad temprana. Otros modelos de ratón reciben su nombre según sus características físicas o comportamientos.

Existen varias variantes del procedimiento para producir ratones knockout; el siguiente es un ejemplo típico.

1. El gen que se va a inactivar se aísla de una biblioteca genética de ratón . A continuación, se diseña una nueva secuencia de ADN muy similar al gen original y a su secuencia adyacente, pero modificada lo suficiente como para que el gen sea inoperante. Generalmente, a la nueva secuencia se le añade un gen marcador , un gen que los ratones normales no poseen y que confiere resistencia a un agente tóxico específico (por ejemplo, neomicina) o que produce un cambio observable (por ejemplo, color o fluorescencia). Además, se incluye un segundo gen, como el gen herpes tk+, en la construcción genética para lograr una selección completa.
2. Las células madre embrionarias se aíslan de un blastocisto de ratón (un embrión muy joven ) y se cultivan in vitro . Para este ejemplo, utilizaremos células madre de un ratón blanco.
3. La nueva secuencia del paso 1 se introduce en las células madre del paso 2 mediante electroporación . Mediante el proceso natural de recombinación homóloga, algunas de las células madre electroporadas incorporarán la nueva secuencia con el gen inactivado en sus cromosomas , en lugar del gen original. Las probabilidades de una recombinación exitosa son relativamente bajas, por lo que la mayoría de las células alteradas tendrán la nueva secuencia solo en uno de los dos cromosomas relevantes; se dice que son heterocigotas . Las células transformadas con un vector que contiene el gen de resistencia a la neomicina y el gen herpes tk+ se cultivan en una solución que contiene neomicina y ganciclovir para seleccionar las transformaciones que ocurrieron por recombinación homóloga. Cualquier inserción de ADN que ocurra por inserción aleatoria morirá porque dará positivo tanto para el gen de resistencia a la neomicina como para el gen herpes tk+, cuyo producto génico reacciona con el ganciclovir para producir una toxina letal. Además, las células que no integran ningún material genético darán negativo para ambos genes y, por lo tanto, morirán como resultado de la intoxicación con neomicina.
4. Las células madre embrionarias que incorporaron el gen inactivado se aíslan de las células no alteradas utilizando el gen marcador del paso 1. Por ejemplo, las células no alteradas pueden eliminarse mediante un agente tóxico al que las células alteradas son resistentes.
5. Las células madre embrionarias modificadas genéticamente del paso 4 se insertan en un blastocisto de ratón . Para este ejemplo, utilizamos blastocistos de un ratón gris. Los blastocistos contienen ahora dos tipos de células madre: las originales (del ratón gris) y las modificadas genéticamente (del ratón blanco). Estos blastocistos se implantan en el útero de ratonas, donde se desarrollan. Los ratones recién nacidos serán, por lo tanto, quimeras : algunas partes de su cuerpo provienen de las células madre originales y otras de las modificadas genéticamente. Su pelaje presentará manchas blancas y grises, siendo las manchas blancas derivadas de las células madre modificadas genéticamente y las grises del blastocisto receptor.
6. Algunos de los ratones quiméricos recién nacidos tendrán gónadas derivadas de células madre con el gen inactivado, y por lo tanto producirán óvulos o espermatozoides que contendrán dicho gen. Cuando estos ratones quiméricos se cruzan con otros de tipo silvestre, parte de su descendencia tendrá una copia del gen inactivado en todas sus células. Estos ratones no conservan ADN de ratón gris y no son quimeras, aunque siguen siendo heterocigotos.
7. Cuando estos descendientes heterocigotos se cruzan entre sí, algunos de sus descendientes heredarán el gen inactivado de ambos padres; no portan ninguna copia funcional del gen original no alterado (es decir, son homocigotos para ese alelo).

Una explicación detallada de cómo se crean los ratones knockout (KO) se encuentra en el sitio web del Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007. ^{[ 4 ]}

Los Institutos Nacionales de Salud analizan algunas limitaciones importantes de esta técnica. ^{[ 5 ]}

Si bien la tecnología de ratones knockout representa una valiosa herramienta de investigación, presenta algunas limitaciones importantes. Aproximadamente el 15 % de los genes knockout son letales para el desarrollo, lo que significa que los embriones modificados genéticamente no pueden convertirse en ratones adultos. Este problema suele superarse mediante el uso de mutaciones condicionales . La falta de ratones adultos limita los estudios al desarrollo embrionario y, a menudo, dificulta la determinación de la función de un gen en relación con la salud humana . En algunos casos, el gen puede desempeñar una función diferente en adultos que en embriones en desarrollo.

La inactivación de un gen también puede no producir un cambio observable en un ratón, o incluso generar características diferentes a las observadas en humanos con el mismo gen inactivado. Por ejemplo, las mutaciones en el gen p53 están asociadas con más de la mitad de los cánceres humanos y suelen provocar tumores en un conjunto específico de tejidos. Sin embargo, cuando se inactiva el gen p53 en ratones, estos desarrollan tumores en una variedad diferente de tejidos.

Existe variabilidad en todo el procedimiento, dependiendo en gran medida de la cepa de la que se hayan derivado las células madre. Generalmente se utilizan células derivadas de la cepa 129. Esta cepa específica no es adecuada para muchos experimentos (por ejemplo, de comportamiento), por lo que es muy común retrocruzar la descendencia con otras cepas. Se ha demostrado que algunos loci genómicos son muy difíciles de eliminar. Las razones podrían ser la presencia de secuencias repetitivas, metilación extensa del ADN o heterocromatina . La presencia confusa de genes 129 vecinos en el segmento de material genético eliminado se ha denominado "efecto de genes flanqueantes". ^{[ 6 ]} Se han propuesto métodos y directrices para abordar este problema. ^{[ 7 ] [ 8 ]}

Otra limitación es que los ratones knockout convencionales (es decir, no condicionales) se desarrollan en ausencia del gen que se investiga. En ocasiones, la pérdida de actividad durante el desarrollo puede enmascarar la función del gen en la edad adulta, especialmente si este interviene en numerosos procesos que abarcan todo el desarrollo. Por lo tanto, se requieren enfoques de mutación condicional/inducible que permitan al ratón desarrollarse y madurar normalmente antes de la ablación del gen de interés.

Otra limitación importante es la falta de adaptaciones evolutivas en el modelo knockout que podrían ocurrir en animales de tipo salvaje después de que muten naturalmente. Por ejemplo, la coexpresión específica de eritrocitos de ^GLUT1 con estomatina constituye un mecanismo compensatorio en mamíferos que no pueden sintetizar vitamina C. [ ^{9 ]}

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