ADN ligasa

La ADN ligasa es un tipo de enzima que facilita la unión de las hebras de ADN catalizando la formación de un enlace fosfodiéster . Desempeña un papel en la reparación de roturas de una sola hebra en el ADN bicatenario de los organismos vivos, pero algunas formas (como la ADN ligasa IV ) pueden reparar específicamente roturas de doble hebra (es decir, una rotura en ambas hebras complementarias del ADN). Las roturas de una sola hebra son reparadas por la ADN ligasa utilizando la hebra complementaria de la doble hélice como plantilla, ^{[ 1 ]} y la ADN ligasa crea el enlace fosfodiéster final para reparar completamente el ADN.

La ADN ligasa se utiliza tanto en la reparación como en la replicación del ADN (véase Ligasas de mamíferos ). Además, la ADN ligasa se utiliza ampliamente en laboratorios de biología molecular para experimentos con ADN recombinante (véase Aplicaciones en investigación ). La ADN ligasa purificada se utiliza en la clonación de genes para unir moléculas de ADN y formar ADN recombinante .

El mecanismo de la ADN ligasa consiste en formar dos enlaces fosfodiéster covalentes entre los extremos hidroxilo 3' de un nucleótido ("aceptor") y el extremo fosfato 5' de otro ("donador"). Se consumen dos moléculas de ATP por cada enlace fosfodiéster formado. ^{[ 2 ]} El AMP es necesario para la reacción de la ligasa, que se desarrolla en cuatro pasos:

1. Reorganización del sitio de actividad, como muescas en segmentos de ADN o fragmentos de Okazaki, etc.
2. La adenililación (adición de AMP) de un residuo de lisina en el centro activo de la enzima libera pirofosfato ;
3. Transferencia del AMP al fosfato 5' del llamado donador, formación de un enlace pirofosfato;
4. Formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5' del donador y el hidroxilo 3' del aceptor. ^{[ 3 ]}

La ligasa también funciona con extremos romos , aunque se requieren concentraciones de enzima más altas y condiciones de reacción diferentes.

Existen al menos tres unidades diferentes que se utilizan para medir la actividad de la ADN ligasa: ^{[ 15 ]}

• Unidad Weiss : cantidad de ligasa que cataliza el intercambio de 1 nmol de ^{32P del} pirofosfato inorgánico a ATP en 20 minutos a 37 ^° C. Esta es la unidad más utilizada.
• Unidad Modrich-Lehman : esta se usa raramente, y una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 100 nmoles de d(AT) _n en una forma resistente a la exonucleasa III en 30 minutos en condiciones estándar.
• Muchos proveedores comerciales de ligasas utilizan una unidad arbitraria basada en la capacidad de la ligasa para ligar extremos cohesivos. Estas unidades suelen ser más subjetivas que cuantitativas y carecen de precisión.

Las ligasas de ADN se han convertido en herramientas indispensables en la investigación moderna de biología molecular para generar secuencias de ADN recombinante . Por ejemplo, las ligasas de ADN se utilizan con enzimas de restricción para insertar fragmentos de ADN, a menudo genes , en plásmidos .

Controlar la temperatura óptima es un aspecto vital para realizar experimentos de recombinación eficientes que involucren la ligación de fragmentos con extremos cohesivos. La mayoría de los experimentos utilizan la ADN ligasa T4 (aislada del bacteriófago T4 ), que es más activa a 37  °C. ^{[ 16 ]} Sin embargo, para una eficiencia de ligación óptima con fragmentos con extremos cohesivos ("extremos pegajosos"), la temperatura óptima de la enzima debe estar equilibrada con la temperatura de fusión T _m de los extremos pegajosos que se están ligando, ^{[ 17 ]} el emparejamiento homólogo de los extremos pegajosos no será estable porque la alta temperatura interrumpe los enlaces de hidrógeno . Una reacción de ligación es más eficiente cuando los extremos pegajosos ya están recocidos de forma estable, y la interrupción de los extremos de recocido daría como resultado una baja eficiencia de ligación. Cuanto más corto sea el saliente , menor será la T _m .

Dado que los fragmentos de ADN de extremos romos no tienen extremos cohesivos que puedan hibridar, la temperatura de fusión no es un factor a considerar dentro del rango de temperatura normal de la reacción de ligación. El factor limitante en la ligación de extremos romos no es la actividad de la ligasa, sino el número de alineamientos que se producen entre los extremos de los fragmentos de ADN. Por lo tanto, la temperatura de ligación más eficiente para el ADN de extremos romos sería aquella en la que se produce el mayor número de alineamientos. La mayoría de las ligaciones de extremos romos se realizan a 14-25  °C durante la noche. La ausencia de extremos hibridados de forma estable también implica que la eficiencia de la ligación disminuye, lo que requiere el uso de una mayor concentración de ligasa. ^{[ 17 ]}

Un uso novedoso de la ADN ligasa se observa en el campo de la nanoquímica, específicamente en el ADN origami.  Los principios de autoensamblaje basados ​​en ADN han demostrado ser útiles para organizar objetos a nanoescala, como biomoléculas, nanomáquinas y componentes nanoelectrónicos y fotónicos. El ensamblaje de dichas nanoestructuras requiere la creación de una intrincada red de moléculas de ADN. Si bien el autoensamblaje de ADN es posible sin ayuda externa utilizando diferentes sustratos, como la superficie catatónica de una lámina de aluminio, la ADN ligasa puede proporcionar la asistencia enzimática necesaria para formar la estructura reticular del ADN a partir de los extremos sobresalientes. ^{[ 18 ]}

La primera ADN ligasa fue purificada y caracterizada en 1967 por los laboratorios de Gellert, Lehman, Richardson y Hurwitz. ^{[ 19 ]} Fue purificada y caracterizada por primera vez por Weiss y Richardson utilizando un proceso de fraccionamiento cromatográfico de seis pasos que comenzó con la eliminación de restos celulares y la adición de estreptomicina, seguido de varios lavados con columna de dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y un fraccionamiento final con fosfocelulosa. El extracto final contenía el 10% de la actividad registrada inicialmente en el medio de E. coli ; durante el proceso se descubrió que el ATP y el Mg++ eran necesarios para optimizar la reacción. Las ADN ligasas comunes disponibles comercialmente fueron descubiertas originalmente en el bacteriófago T4 , E. coli y otras bacterias . ^{[ 20 ]}  

Las deficiencias genéticas en las ADN ligasas humanas se han asociado con síndromes clínicos caracterizados por inmunodeficiencia, sensibilidad a la radiación y anomalías del desarrollo, ^{[ 19 ]} El síndrome LIG4 (síndrome de ligasa IV) es una enfermedad rara asociada con mutaciones en la ADN ligasa 4 e interfiere con los mecanismos de reparación de roturas de ADN bicatenario. El síndrome de ligasa IV causa inmunodeficiencia en individuos y se asocia comúnmente con microcefalia e hipoplasia de la médula ósea. ^{[ 21 ]} A continuación se presenta una lista de enfermedades prevalentes causadas por la falta o el mal funcionamiento de la ADN ligasa. 

En estudios recientes, la ADN ligasa I humana se utilizó en el diseño de fármacos asistido por computadora para identificar inhibidores de la ADN ligasa como posibles agentes terapéuticos para tratar el cáncer. ^{[ 25 ]} Dado que el crecimiento celular excesivo es un sello distintivo del desarrollo del cáncer, la quimioterapia dirigida que interrumpe el funcionamiento de la ADN ligasa puede impedir las formas adyuvantes del cáncer. Además, se ha demostrado que las ADN ligasas se pueden dividir en dos categorías principales: dependientes de ATP y dependientes de NAD ⁺ . Investigaciones previas han demostrado que, si bien se han descubierto ADN ligasas dependientes de NAD ⁺ en nichos celulares o virales esporádicos fuera del dominio bacteriano de la vida, no existe ningún caso en el que una ligasa dependiente de NAD ⁺ esté presente en un organismo eucariota . La presencia exclusiva en organismos no eucariotas, la especificidad de sustrato única y la estructura de dominio distintiva de las ADN ligasas humanas dependientes de NAD+ en comparación con las dependientes de ATP hacen que las ligasas dependientes de NAD ⁺ sean objetivos ideales para el desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos. ^{[ 19 ]}

• extremo del ADN
• hebra rezagada
• replicación del ADN
• Fragmento de Okazaki
• ADN polimerasa
• Secuenciación por ligación

• ADN ligasa: molécula del mes de la base de datos PDB
• Información general sobre la ligasa del Davidson College
• Protocolo de ligación de ADN de OpenWetWare
• Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P00970 (ADN ligasa) en el PDBe-KB .
• Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P18858 (ADN ligasa 1) en el PDBe-KB .
• Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P49916 (ADN ligasa 3) en el PDBe-KB .