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MNasa-seq

Digestión con MNasa con secuenciación MNase-seq , abreviatura de digestión de nucleasa microcócica con secuenciación profunda , [ 1] [2] [3] [4] es una técnica de biología molec...

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Digestión con MNasa con secuenciación

MNase-seq , abreviatura de digestión de nucleasa microcócica con secuenciación profunda , [ 1] [2] [3] [4] es una técnica de biología molecular que se utilizó por primera vez en 2006 para medir la ocupación de nucleosomas en el genoma de C. elegans , [1] y posteriormente se aplicó al genoma humano en 2008. [2] Sin embargo, el término "MNase-seq" no se había acuñado hasta un año después, en 2009. [3] En pocas palabras, esta técnica se basa en el uso de la endo - exonucleasa no específica nucleasa microcócica , una enzima derivada de la bacteria Staphylococcus aureus , para unir y escindir regiones de ADN no unidas a proteínas en la cromatina . El ADN unido a histonas u otras proteínas unidas a la cromatina (por ejemplo, factores de transcripción ) puede permanecer sin digerir. Luego, el ADN sin cortar se purifica a partir de las proteínas y se secuencia a través de uno o más de los diversos métodos de secuenciación de próxima generación . [5]

La secuenciación de MNasa es una de las cuatro clases de métodos que se utilizan para evaluar el estado del epigenoma a través del análisis de la accesibilidad de la cromatina. Las otras tres técnicas son la secuenciación de ADNasa , la secuenciación de FAIRE y la secuenciación de ATAC . [4] Si bien la secuenciación de MNasa se utiliza principalmente para secuenciar regiones de ADN unidas por histonas u otras proteínas unidas a la cromatina, [2] las otras tres se utilizan comúnmente para: mapear sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa I (DHS) , [6] secuenciar el ADN no unido por proteínas de la cromatina, [7] o secuenciar regiones de cromatina empaquetada de forma flexible a través de la transposición de marcadores, [8] [9] respectivamente. [4]

Historia

La nucleasa microcócica (MNasa) se descubrió por primera vez en S. aureus en 1956, [10] la proteína se cristalizó en 1966, [11] y se caracterizó en 1967. [12] La digestión de la cromatina con MNasa fue clave para los primeros estudios de la estructura de la cromatina; se utilizó para determinar que cada unidad nucleosómica de cromatina estaba compuesta de aproximadamente 200 pb de ADN. [13] Esto, junto con el modelo de "cuentas en un hilo" de Olins y Olins , [14] confirmó las ideas de Kornberg con respecto a la estructura básica de la cromatina. [15] Tras estudios adicionales, se descubrió que la MNasa no podía degradar el ADN unido a histonas de menos de ~140 pb y que la ADNasa I y II podían degradar el ADN unido a tan solo 10 pb. [16] [17] Esto finalmente dilucidó que ~146 pb de ADN envuelven el núcleo del nucleosoma, [18] ~50 pb de ADN de enlace conectan cada nucleosoma, [19] y que 10 pares de bases continuos de ADN se unen firmemente al núcleo del nucleosoma en intervalos. [17]

Además de usarse para estudiar la estructura de la cromatina, la digestión con nucleasas microcócicas se ha utilizado en experimentos de secuenciación de oligonucleótidos desde su caracterización en 1967. [20] La digestión con MNasa también se utilizó en varios estudios para analizar secuencias libres de cromatina, como el ADN mitocondrial de levadura ( Saccharomyces cerevisiae ) [21] así como el ADN de bacteriófagos [22] [23] a través de su digestión preferencial de regiones ricas en adenina y timina . [24] A principios de la década de 1980, la digestión con MNasa se utilizó para determinar la fase nucleosómica y el ADN asociado para los cromosomas de SV40 maduro , [25] moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ) , [26] levadura, [27] y monos, [28] entre otros. El primer estudio que utilizó esta digestión para estudiar la relevancia de la accesibilidad de la cromatina para la expresión genética en humanos fue en 1985. En este estudio, se utilizó la nucleasa para encontrar la asociación de ciertas secuencias oncogénicas con la cromatina y las proteínas nucleares. [29] Los estudios que utilizan la digestión con MNasa para determinar la posición de los nucleosomas sin secuenciación ni información de matriz continuaron hasta principios de la década de 2000. [30]

Con el advenimiento de la secuenciación del genoma completo a fines de la década de 1990 y principios de la década de 2000, se hizo posible comparar secuencias de ADN purificadas con los genomas eucariotas de S. cerevisiae, [31] Caenorhabditis elegans , [32] D. melanogaster, [33] Arabidopsis thaliana , [34] Mus musculus , [35] y Homo sapiens . [36] La digestión con MNasa se aplicó por primera vez a estudios de ocupación de nucleosomas de todo el genoma en S. cerevisiae [37] acompañada de análisis a través de microarreglos para determinar qué regiones de ADN estaban enriquecidas con nucleosomas resistentes a la MNasa. Los análisis de microarrays basados ​​en MNasa se utilizaron a menudo a escala del genoma completo de la levadura [38] [39] y en regiones genómicas limitadas en humanos [40] [41] para determinar el posicionamiento de los nucleosomas, que podría usarse como una inferencia para la inactivación transcripcional .

En 2006, la secuenciación de próxima generación se combinó por primera vez con la digestión con MNasa para explorar el posicionamiento de los nucleosomas y las preferencias de secuencia de ADN en C. elegans. [ 1] Este fue el primer ejemplo de MNasa-seq en cualquier organismo.

No fue hasta 2008, cuando la secuenciación de próxima generación se estaba volviendo más ampliamente disponible, cuando la digestión con MNasa se combinó con la secuenciación de alto rendimiento, a saber, la secuenciación Solexa/Illumina , para estudiar el posicionamiento nucleosomal a escala de todo el genoma en humanos. [2] Un año después, finalmente se acuñaron los términos “MNasa-Seq” y “MNasa-ChIP”, para la digestión de nucleasas microcócicas con inmunoprecipitación de cromatina . [3] Desde su aplicación inicial en 2006, [1] la MNasa-seq se ha utilizado para secuenciar en profundidad el ADN asociado con la ocupación de nucleosomas y la epigenómica en eucariotas. [5] A febrero de 2020, la MNasa-seq todavía se aplica para analizar la accesibilidad en la cromatina. [42]

Descripción

La cromatina es dinámica y la posición de los nucleosomas en el ADN cambia a través de la actividad de varios factores de transcripción y complejos de remodelación , lo que refleja aproximadamente la actividad transcripcional en estos sitios. El ADN envuelto alrededor de los nucleosomas generalmente es inaccesible a los factores de transcripción. [43] Por lo tanto, la MNasa-seq se puede utilizar para determinar indirectamente qué regiones del ADN son inaccesibles desde el punto de vista transcripcional al determinar directamente qué regiones están unidas a los nucleosomas. [5]

En un experimento típico de MNasa-seq, primero se aíslan los núcleos de células eucariotas de un tejido de interés. Luego, MNasa-seq usa la nucleasa microcócica endo-exonucleasa para unir y escindir regiones de ADN no unidas a proteínas de la cromatina eucariota, primero escindiendo y reseccionando una hebra, luego escindiendo también la hebra antiparalela. [3] La cromatina se puede reticular opcionalmente con formaldehído . [44] La MNasa requiere Ca 2+ como cofactor , típicamente con una concentración final de 1 mM. [5] [12] Si una región de ADN está unida por el núcleo del nucleosoma (es decir, histonas ) u otras proteínas unidas a la cromatina (por ejemplo, factores de transcripción), entonces la MNasa no puede unirse y escindir el ADN. Los nucleosomas o los complejos de ADN-proteína se pueden purificar de la muestra y el ADN unido se puede purificar posteriormente mediante electroforesis en gel y extracción . El ADN purificado es típicamente ~150bp, si se purifica a partir de nucleosomas, [2] o más corto, si se trata de otra proteína (por ejemplo, factores de transcripción). [45] Esto hace que la secuenciación de lectura corta y alto rendimiento sea ideal para MNase-seq ya que las lecturas para estas tecnologías son muy precisas pero solo pueden cubrir un par de cientos de pares de bases continuos de longitud. [46] Una vez secuenciadas, las lecturas se pueden alinear con un genoma de referencia para determinar qué regiones de ADN están unidas por nucleosomas o proteínas de interés, con herramientas como Bowtie . [4] El posicionamiento de los nucleosomas dilucidado, a través de MNase-seq, se puede utilizar para predecir la expresión genómica [47] y la regulación [48] en el momento de la digestión.

Técnicas extendidas

Aplicaciones técnicas de la MNasa en la secuenciación

MNasa-ChIP/Secuenciación CUT&RUN

Recientemente, la MNasa-seq también se ha implementado para determinar dónde se unen los factores de transcripción en el ADN. [49] [50] La ChIP-seq clásica muestra problemas con la calidad de la resolución, la rigurosidad en el protocolo experimental y la fragmentación del ADN . [50] La ChIP-seq clásica generalmente utiliza sonicación para fragmentar la cromatina , lo que sesga las regiones heterocromáticas debido a la unión condensada y estrecha de las regiones de la cromatina entre sí. [50] A diferencia de las histonas , los factores de transcripción solo se unen transitoriamente al ADN. Otros métodos, como la sonicación en ChIP-seq, que requieren el uso de temperaturas y detergentes aumentados, pueden provocar la pérdida del factor. La secuenciación CUT&RUN es una forma novedosa de inmunoprecipitación basada en MNasa . Brevemente, utiliza una MNasa marcada con un anticuerpo para unirse específicamente a las proteínas unidas al ADN que presentan el epítopo reconocido por ese anticuerpo. La digestión se produce entonces específicamente en las regiones que rodean a ese factor de transcripción, lo que permite que este complejo se difunda fuera del núcleo y se obtenga sin tener que preocuparse por un fondo significativo ni por las complicaciones de la sonicación. El uso de esta técnica no requiere altas temperaturas ni altas concentraciones de detergente. Además, la MNasa mejora la digestión de la cromatina debido a su actividad exonucleasa y endonucleasa. Las células se lisan en una solución de SDS / Triton X-100 . Luego, se agrega el complejo MNasa-anticuerpo. Y finalmente, se puede aislar el complejo proteína-ADN, y posteriormente se purifica y secuencia el ADN . El extracto soluble resultante contiene un enriquecimiento de 25 veces en fragmentos de menos de 50 pb. Este mayor enriquecimiento da como resultado datos de alta resolución rentables. [50]

MNasa-seq de célula única

La secuenciación de nucleasas microcócicas de células individuales (scMNasa-seq) es una técnica novedosa que se utiliza para analizar la posición de los nucleosomas e inferir la accesibilidad de la cromatina con el uso de una sola entrada de células. [51] Primero, las células se clasifican en alícuotas individuales utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . [51] Luego, las células se lisan y se digieren con nucleasas microcócicas. El ADN aislado se somete a amplificación por PCR y luego se aísla y analiza la secuencia deseada. [51] El uso de MNasa en ensayos de células individuales da como resultado una mayor detección de regiones como los sitios hipersensibles a la ADNasa I, así como los sitios de unión de factores de transcripción. [51]

Comparación con otros ensayos de accesibilidad de la cromatina

MNase-seq es uno de los cuatro métodos principales ( DNase-seq , MNase-seq, FAIRE-seq y ATAC-seq ) para la determinación más directa de la accesibilidad de la cromatina y las consecuencias posteriores para la expresión génica . [52] Las cuatro técnicas se contrastan con ChIP-seq , que se basa en la inferencia de que ciertas marcas en las colas de las histonas son indicativas de la activación o represión génica, [53] no evaluando directamente el posicionamiento de los nucleosomas, sino siendo valiosos para la evaluación de la función enzimática modificadora de las histonas. [4]

Secuenciación de ADNasa

Al igual que con MNase-seq, [2] DNase-seq se desarrolló combinando una endonucleasa de ADN existente [6] con tecnología de secuenciación de próxima generación para analizar la accesibilidad de la cromatina. [54] Ambas técnicas se han utilizado en varios eucariotas para determinar información sobre la posición de los nucleosomas en los respectivos organismos [4] y ambas se basan en el mismo principio de digerir ADN abierto para aislar bandas de ADN de ~140 pb de los nucleosomas [2] [55] o bandas más cortas si se determina información del factor de transcripción. [45] [55] Ambas técnicas se han optimizado recientemente para la secuenciación de células individuales, lo que corrige una de las principales desventajas de ambas técnicas; que es el requisito de una gran entrada de células. [56] [51]

En concentraciones suficientes, la DNasa I es capaz de digerir el ADN unido al nucleosoma hasta 10 pb, mientras que la nucleasa microcócica no puede. [17] Además, la DNasa-seq se utiliza para identificar DHS, que son regiones de ADN que son hipersensibles al tratamiento con DNasa y que a menudo son indicativas de regiones reguladoras (por ejemplo, promotores o potenciadores ). [57] No se encuentra un efecto equivalente con la MNasa. Como resultado de esta distinción, la DNasa-seq se utiliza principalmente para identificar directamente las regiones reguladoras, mientras que la MNasa-seq se utiliza para identificar el factor de transcripción y la ocupación nucleosómica para inferir indirectamente los efectos sobre la expresión génica. [4]

FAIRE-secuencia

FAIRE-seq difiere más de MNase-seq que de DNase-seq. [4] FAIRE-seq se desarrolló en 2007 [7] y se combinó con la secuenciación de próxima generación tres años después para estudiar los DHS. [58] FAIRE-seq se basa en el uso de formaldehído para entrecruzar las proteínas objetivo con el ADN y luego la sonicación posterior y la extracción con fenol-cloroformo para separar el ADN no entrecruzado del ADN entrecruzado. El ADN no entrecruzado se secuencia y analiza, lo que permite la observación directa de la cromatina abierta. [59]

La MNasa-seq no mide la accesibilidad de la cromatina tan directamente como la FAIRE-seq. Sin embargo, a diferencia de la FAIRE-seq, no requiere necesariamente reticulación, [5] ni depende de la sonicación, [4] pero puede requerir extracción con fenol y cloroformo . [5] Dos desventajas importantes de la FAIRE-seq, en relación con las otras tres clases, son la entrada mínima requerida de 100.000 células y la dependencia de la reticulación. [7] La ​​reticulación puede unir otras proteínas unidas a la cromatina que interactúan transitoriamente con el ADN, lo que limita la cantidad de ADN no reticulado que se puede recuperar y analizar de la fase acuosa. [52] Por lo tanto, la resolución general obtenida de FAIRE-seq puede ser relativamente menor que la de DNase-seq o MNase-seq [52] y con el requisito de 100.000 células, [7] los equivalentes de una sola célula de DNase-seq [56] o MNase-seq [51] los convierten en alternativas mucho más atractivas. [4]

secuencia ATAC

ATAC-seq es la clase de ensayos de accesibilidad de cromatina desarrollada más recientemente. [8] ATAC-seq utiliza una transposasa hiperactiva para insertar marcadores transponibles con adaptadores específicos, capaces de unirse a cebadores para la secuenciación, en regiones abiertas de cromatina. Luego, se puede utilizar la PCR para amplificar secuencias adyacentes a los transposones insertados, lo que permite la determinación de secuencias de cromatina abiertas sin causar un cambio en la estructura de la cromatina. [8] [9] ATAC-seq ha demostrado ser eficaz en humanos, entre otros eucariotas, incluso en muestras congeladas. [60] Al igual que con DNase-seq [56] y MNase-seq, [51] también se ha desarrollado una versión exitosa de ATAC-seq para una sola célula. [61]

La ATAC-seq tiene varias ventajas sobre la MNasa-seq en la evaluación de la accesibilidad de la cromatina. La ATAC-seq no depende de la digestión variable de la nucleasa microcócica, ni de la reticulación o la extracción con fenol-cloroformo. [5] [9] Generalmente mantiene la estructura de la cromatina, por lo que los resultados de la ATAC-seq se pueden utilizar para evaluar directamente la accesibilidad de la cromatina, en lugar de hacerlo indirectamente a través de la MNasa-seq. La ATAC-seq también se puede completar en unas pocas horas, [9] mientras que las otras tres técnicas suelen requerir períodos de incubación durante la noche. [5] [6] [7] Las dos principales desventajas de la ATAC-seq, en comparación con la MNasa-seq, son el requisito de una mayor cobertura de secuenciación y la prevalencia de la contaminación mitocondrial debido a la inserción no específica de ADN tanto en el ADN mitocondrial como en el ADN nuclear. [8] [9] A pesar de estas desventajas menores, el uso de la ATAC-seq sobre las alternativas es cada vez más frecuente. [4]

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