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Diagnóstico molecular

Especialista en el uso de "QIAsymphony", una plataforma de automatización para pruebas de diagnóstico molecular. El diagnóstico molecular es un conjunto de técnicas utilizadas p...

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Especialista en el uso de "QIAsymphony", una plataforma de automatización para pruebas de diagnóstico molecular.

El diagnóstico molecular es un conjunto de técnicas utilizadas para analizar marcadores biológicos en el genoma y el proteoma , y ​​cómo sus células expresan sus genes como proteínas , aplicando la biología molecular a las pruebas médicas . En medicina, la técnica se utiliza para diagnosticar y monitorear enfermedades, detectar riesgos y decidir qué terapias funcionarán mejor para cada paciente, [ 1 ] [ 2 ] : prólogo y en bioseguridad agrícola de manera similar para monitorear enfermedades de cultivos y ganado , estimar riesgos y decidir qué medidas de cuarentena deben tomarse. [ 3 ]

Al analizar las especificidades del paciente y su enfermedad, el diagnóstico molecular ofrece la perspectiva de la medicina personalizada . [ 4 ] Estas pruebas son útiles en una variedad de especialidades médicas , incluyendo enfermedades infecciosas , oncología , tipificación de antígenos leucocitarios humanos (que investiga y predice la función inmunitaria ), coagulación y farmacogenómica : la predicción genética de qué fármacos funcionarán mejor. [ 5 ] : v-vii Se superponen con la química clínica (pruebas médicas en fluidos corporales).

Historia

El diagnóstico molecular utiliza técnicas como la espectrometría de masas y los microarrays genéticos para capturar los patrones de expresión de genes y proteínas.

El campo de la biología molecular creció a finales del siglo XX, al igual que su aplicación clínica. En 1980, Yuet Wai Kan et al . propusieron una prueba genética prenatal para la talasemia que no se basaba en la secuenciación del ADN —entonces en sus inicios— sino en enzimas de restricción que cortaban el ADN donde reconocían secuencias cortas específicas, creando diferentes longitudes de cadena de ADN según el alelo (variación genética) que poseía el feto. [ 6 ] En la década de 1980, la frase se utilizó en los nombres de empresas como Molecular Diagnostics Incorporated [ 7 ] y Bethesda Research Laboratories Molecular Diagnostics . [ 8 ] [ 9 ]

Durante la década de 1990, la identificación de genes recién descubiertos y nuevas técnicas para la secuenciación del ADN condujeron a la aparición de un campo distinto de la medicina de laboratorio molecular y genómica; en 1995, se formó la Asociación de Patología Molecular (AMP) para darle estructura. En 1999, la AMP cofundó The Journal of Medical Diagnostics . [ 10 ] Informa Healthcare lanzó Expert Reviews in Medical Diagnostics en 2001. [ 1 ] A partir de 2002, el Proyecto HapMap agregó información sobre las diferencias genéticas de una letra que se repiten en la población humana —los polimorfismos de un solo nucleótido— y su relación con la enfermedad. [ 2 ] : cap. 37 En 2012, las técnicas de diagnóstico molecular para la talasemia utilizan pruebas de hibridación genética para identificar el polimorfismo de un solo nucleótido específico que causa la enfermedad de un individuo. [ 11 ]

A medida que la aplicación comercial del diagnóstico molecular ha cobrado mayor importancia, también lo ha hecho el debate sobre la patentabilidad de los descubrimientos genéticos que lo sustentan . En 1998, la Directiva 98/44/CE de la Unión Europea aclaró que las patentes sobre secuencias de ADN eran admisibles. [ 12 ] En 2010, en Estados Unidos, AMP demandó a Myriad Genetics para impugnar sus patentes relativas a dos genes, BRCA1 y BRCA2 , asociados al cáncer de mama. En 2013, el Tribunal Supremo de Estados Unidos coincidió parcialmente , dictaminando que una secuencia genética de origen natural no podía patentarse. [ 13 ] [ 14 ]

Técnicas

El Affymetrix 5.0, un chip de microarrays

Desarrollo a partir de herramientas de investigación

La industrialización de las herramientas de análisis de biología molecular ha hecho posible su uso en clínicas. [ 2 ] : prólogo La miniaturización en un único dispositivo portátil puede llevar el diagnóstico médico a la clínica, al consultorio o al hogar. [ 2 ] : prólogo El laboratorio clínico requiere altos estándares de confiabilidad; los diagnósticos pueden requerir acreditación o estar sujetos a las regulaciones de dispositivos médicos. [ 15 ] A partir de 2011, sin embargo, algunos laboratorios clínicos estadounidenses utilizaron ensayos vendidos para "uso exclusivo en investigación". [ 16 ]

Los procesos de laboratorio deben cumplir con regulaciones como las Enmiendas para la Mejora de los Laboratorios Clínicos , la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico (HIPAA) , las Buenas Prácticas de Laboratorio y las especificaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos ( FDA) en los Estados Unidos. Los Sistemas de Gestión de Información de Laboratorio ayudan a realizar un seguimiento de estos procesos. [ 17 ] La regulación se aplica tanto al personal como a los suministros. A partir de 2012Doce estados de EE. UU. exigen que los patólogos moleculares tengan licencia; varias juntas, como la Junta Estadounidense de Genética Médica y la Junta Estadounidense de Patología, certifican a tecnólogos, supervisores y directores de laboratorio. [ 18 ]

La automatización y el código de barras de las muestras maximizan el rendimiento y reducen la posibilidad de errores o contaminación durante la manipulación manual y la presentación de resultados. Actualmente, existen dispositivos únicos para realizar el ensayo de principio a fin. [ 15 ]

ensayos

El diagnóstico molecular utiliza ensayos biológicos in vitro como PCR- ELISA o hibridación fluorescente in situ . [ 19 ] [ 20 ] El ensayo detecta una molécula, a menudo en bajas concentraciones, que es un marcador de enfermedad o riesgo en una muestra tomada de un paciente. La conservación de la muestra antes del análisis es fundamental. Debe minimizarse la manipulación manual. [ 21 ] La frágil molécula de ARN plantea ciertos desafíos. Como parte del proceso celular de expresión de genes como proteínas, ofrece una medida de la expresión génica, pero es vulnerable a la hidrólisis y degradación por las enzimas ARNasa, siempre presentes . Las muestras pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido o incubarse en agentes de conservación. [ 2 ] : cap. 39

Debido a que los métodos de diagnóstico molecular pueden detectar marcadores sensibles, estas pruebas son menos invasivas que una biopsia tradicional . Por ejemplo, debido a que existen ácidos nucleicos libres de células en el plasma humano , una simple muestra de sangre puede ser suficiente para obtener información genética de tumores, trasplantes o un feto nonato. [ 2 ] : cap. 45 Muchos, pero no todos, los métodos de diagnóstico molecular basados ​​en la detección de ácidos nucleicos utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aumentar enormemente el número de moléculas de ácido nucleico, amplificando así la(s) secuencia(s) objetivo en la muestra del paciente. [ 2 ] : prólogo La PCR es un método en el que se amplifica un ADN molde utilizando cebadores sintéticos, una ADN polimerasa y dNTPs. La mezcla se somete a ciclos entre al menos 2 temperaturas: una temperatura alta para desnaturalizar el ADN de doble cadena en moléculas de cadena simple y una temperatura baja para que el cebador se hibride con el molde y para que la polimerasa extienda el cebador. Cada ciclo de temperatura teóricamente duplica la cantidad de secuencia objetivo. La detección de variaciones de secuencia mediante PCR generalmente implica el diseño y uso de reactivos de oligonucleótidos que amplifican la variante de interés de manera más eficiente que la secuencia de tipo silvestre. La PCR es actualmente el método más utilizado para la detección de secuencias de ADN. [ 22 ] La detección del marcador puede utilizar PCR en tiempo real, secuenciación directa, [ 2 ] : ch 17 chips de microarrays — chips prefabricados que prueban muchos marcadores a la vez, [ 2 ] : ch 24 o MALDI-TOF [ 23 ] El mismo principio se aplica al proteoma y al genoma . Los arrays de proteínas de alto rendimiento pueden usar ADN complementario o anticuerpos para unirse y, por lo tanto, pueden detectar muchas proteínas diferentes en paralelo. [ 24 ] Las pruebas de diagnóstico molecular varían ampliamente en sensibilidad, tiempo de respuesta, costo, cobertura y aprobación regulatoria. También varían en el nivel de validación aplicado en los laboratorios que las utilizan. Por lo tanto, se requiere una validación local sólida de acuerdo con los requisitos regulatorios y el uso de controles apropiados, especialmente cuando el resultado puede usarse para informar una decisión de tratamiento del paciente. [ 25 ]

Beneficios

Un chip de microarrays contiene ADN complementario (ADNc) para muchas secuencias de interés. El ADNc emite fluorescencia cuando se hibrida con un fragmento de ADN coincidente en la muestra.

Prenatal

Las pruebas prenatales convencionales para detectar anomalías cromosómicas como el síndrome de Down se basan en el análisis del número y la apariencia de los cromosomas ( el cariotipo ). Las pruebas de diagnóstico molecular, como la hibridación genómica comparativa mediante microarrays , analizan una muestra de ADN y, debido a la presencia de ADN libre en el plasma, podrían ser menos invasivas; sin embargo, a fecha de 2013, siguen siendo un complemento de las pruebas convencionales. [ 26 ]

Tratamiento

Algunos polimorfismos de un solo nucleótido de un paciente —ligeras diferencias en su ADN— pueden ayudar a predecir la rapidez con la que metabolizarán ciertos fármacos; esto se denomina farmacogenómica . [ 27 ] Por ejemplo, la enzima CYP2C19 metaboliza varios fármacos, como el anticoagulante clopidogrel , en sus formas activas. Algunos pacientes poseen polimorfismos en lugares específicos del gen 2C19 que los convierten en metabolizadores deficientes de esos fármacos; los médicos pueden analizar estos polimorfismos y determinar si los fármacos serán completamente efectivos para ese paciente. [ 28 ] Los avances en biología molecular han ayudado a demostrar que algunos síndromes que antes se clasificaban como una sola enfermedad son en realidad múltiples subtipos con causas y tratamientos completamente diferentes. El diagnóstico molecular puede ayudar a diagnosticar el subtipo —por ejemplo, de infecciones y cánceres— o el análisis genético de una enfermedad con un componente hereditario, como el síndrome de Silver-Russell . [ 1 ] [ 29 ]

Enfermedad infecciosa

Los diagnósticos moleculares se utilizan para identificar enfermedades infecciosas como la clamidia , [ 30 ] el virus de la influenza [ 31 ] y la tuberculosis ; [ 32 ] o cepas específicas como el virus H1N1 [ 33 ] o el SARS-CoV-2 . [ 34 ] La identificación genética puede ser rápida; por ejemplo, una prueba de amplificación isotérmica mediada por bucle diagnostica el parásito de la malaria y es lo suficientemente robusta para los países en desarrollo. [ 35 ] Pero a pesar de estos avances en el análisis del genoma, en 2013 las infecciones todavía se identifican con mayor frecuencia por otros medios : su proteoma, bacteriófago o perfil cromatográfico . [ 36 ] Los diagnósticos moleculares también se utilizan para comprender la cepa específica del patógeno , por ejemplo, detectando qué genes de resistencia a los medicamentos posee , y por lo tanto qué terapias evitar. [ 37 ] [ 36 ] Además, se pueden implementar ensayos basados ​​en la secuenciación metagenómica de próxima generación para identificar organismos patógenos sin sesgo. [ 38 ]

Gestión del riesgo de enfermedades

El genoma de un paciente puede incluir una mutación hereditaria o aleatoria que afecta la probabilidad de desarrollar una enfermedad en el futuro. [ 27 ] Por ejemplo, el síndrome de Lynch es una enfermedad genética que predispone a los pacientes a cáncer colorrectal y otros tipos de cáncer; la detección temprana puede conducir a un seguimiento cercano que mejora las posibilidades del paciente de un buen resultado. [ 39 ] El riesgo cardiovascular se indica mediante marcadores biológicos y el cribado puede medir el riesgo de que un niño nazca con una enfermedad genética como la fibrosis quística . [ 40 ] Las pruebas genéticas son éticamente complejas: los pacientes pueden no querer el estrés de conocer su riesgo. [ 41 ] En países sin atención médica universal, un riesgo conocido puede aumentar las primas de los seguros. [ 42 ]

Cáncer

El cáncer es un cambio en los procesos celulares que causa que un tumor crezca sin control. [ 27 ] Las células cancerosas a veces tienen mutaciones en oncogenes , como KRAS y CTNNB1 (β - catenina). [ 43 ] El análisis de la firma molecular de las células cancerosas —el ADN y sus niveles de expresión a través del ARN mensajero— permite a los médicos caracterizar el cáncer y elegir la mejor terapia para sus pacientes. [ 27 ] Desde 2010, los ensayos que incorporan una serie de anticuerpos contra moléculas marcadoras de proteínas específicas son una tecnología emergente; hay esperanzas para estos ensayos multiplex que podrían medir muchos marcadores a la vez. [ 44 ] Otros posibles biomarcadores futuros incluyen moléculas de microARN , que las células cancerosas expresan en mayor cantidad que las sanas. [ 45 ]

El cáncer es una enfermedad con causas moleculares complejas y una evolución constante. Además, presenta heterogeneidad incluso dentro de un mismo individuo. Los estudios moleculares del cáncer han demostrado la importancia de las mutaciones impulsoras en el crecimiento y la metástasis de los tumores. [ 46 ] Se han desarrollado numerosas tecnologías para la detección de variaciones de secuencia en la investigación del cáncer. Estas tecnologías generalmente se pueden agrupar en tres enfoques: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación y secuenciación de próxima generación (NGS). [ 22 ] Actualmente, muchos ensayos de PCR e hibridación han sido aprobados por la FDA como diagnósticos in vitro. [ 47 ] Sin embargo, los ensayos de NGS aún se encuentran en una etapa temprana en el diagnóstico clínico. [ 48 ]

Para realizar la prueba de diagnóstico molecular del cáncer, uno de los aspectos más importantes es la detección de variaciones en la secuencia de ADN. Las muestras de biopsia tumoral utilizadas para el diagnóstico siempre contienen tan solo un 5 % de la variante objetivo en comparación con la secuencia de tipo silvestre. Además, para aplicaciones no invasivas a partir de sangre periférica u orina, la prueba de ADN debe ser lo suficientemente específica como para detectar mutaciones con frecuencias alélicas variantes inferiores al 0,1 %. [ 22 ]

Actualmente, mediante la optimización de la PCR tradicional, existe una nueva invención, el sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS), un método para detectar variantes de secuencia de ADN en el cáncer. El principio detrás de ARMS es que la actividad de extensión enzimática de las ADN polimerasas es altamente sensible a los desajustes cerca del extremo 3' del cebador. [ 22 ] Muchas empresas diferentes han desarrollado pruebas de diagnóstico basadas en cebadores de PCR ARMS. Por ejemplo, Qiagen therascreen, [ 49 ] Roche cobas [ 50 ] y Biomerieux THxID [ 51 ] han desarrollado pruebas de PCR aprobadas por la FDA para detectar mutaciones de cáncer de pulmón, colon y melanoma metastásico en los genes KRAS, EGFR y BRAF. Sus kits de diagnóstico in vitro fueron básicamente validados en ADN genómico extraído de tejido FFPE.

También existen microarrays que utilizan el mecanismo de hibridación para diagnosticar el cáncer. Se pueden sintetizar más de un millón de sondas diferentes en un array con la tecnología Genechip de Affymetrix, con un límite de detección de una a diez copias de ARNm por pocillo. [ 22 ] Los microarrays optimizados se consideran generalmente para producir una cuantificación relativa repetible de diferentes objetivos. [ 52 ] Actualmente, la FDA ya ha aprobado varios ensayos de diagnóstico que utilizan microarrays: los ensayos MammaPrint de Agendia pueden informar sobre el riesgo de recurrencia del cáncer de mama mediante el perfilado de la expresión de 70 genes relacionados con el cáncer de mama; [ 53 ] el ensayo INFNITI CYP2C19 de Autogenomics puede perfilar polimorfismos genéticos, cuyos impactos en la respuesta terapéutica a los antidepresivos son grandes; [ 54 ] y CytoScan Dx de Affymetrix puede evaluar discapacidades intelectuales y trastornos congénitos mediante el análisis de mutaciones cromosómicas. [ 55 ]

En el futuro, las herramientas de diagnóstico para el cáncer probablemente se centrarán en la secuenciación de próxima generación (NGS). Al utilizar la secuenciación de ADN y ARN para realizar diagnósticos de cáncer, la tecnología en el campo de las herramientas de diagnóstico molecular se desarrollará mejor. Aunque el rendimiento y el precio de la NGS se han reducido drásticamente en los últimos 10 años en aproximadamente 100 veces, todavía estamos al menos 6 órdenes de magnitud lejos de realizar una secuenciación profunda a nivel de todo el genoma. [ 22 ] Actualmente, Ion Torrent ha desarrollado algunos paneles de NGS basados ​​en AmpliSeq traslacional, por ejemplo, el Oncomine Comprehensive Assay. [ 56 ] Se están centrando en utilizar la secuenciación profunda de genes relacionados con el cáncer para detectar variantes de secuencia raras.

Las herramientas de diagnóstico molecular pueden utilizarse para evaluar el riesgo de cáncer. Por ejemplo, la prueba BRCA1/2 de Myriad Genetics evalúa el riesgo de cáncer de mama a lo largo de la vida en mujeres. [ 22 ] Además, algunos tipos de cáncer no siempre presentan síntomas claros. Es útil analizar a las personas cuando no muestran síntomas evidentes y, por lo tanto, detectar el cáncer en etapas tempranas. Por ejemplo, la prueba ColoGuard puede utilizarse para detectar el cáncer colorrectal en personas mayores de 55 años . [ 57 ] El cáncer es una enfermedad de larga duración con diversas etapas de progresión; las herramientas de diagnóstico molecular pueden utilizarse para pronosticar su progresión. Por ejemplo, la prueba OncoType Dx de Genomic Health puede estimar el riesgo de cáncer de mama. Su tecnología puede informar a las pacientes sobre la necesidad de quimioterapia cuando sea necesario, mediante el análisis de los niveles de expresión de ARN en el tejido de la biopsia de cáncer de mama. [ 58 ]

Gracias al creciente apoyo gubernamental a los diagnósticos moleculares de ADN, se prevé que pronto estará disponible un número cada vez mayor de pruebas clínicas de detección de ADN para el cáncer. Actualmente, la investigación en diagnóstico oncológico avanza rápidamente con el objetivo de reducir costes, ahorrar tiempo y simplificar los métodos tanto para médicos como para pacientes.

Alergia

El diagnóstico molecular se utiliza cada vez más en alergología, especialmente para alergias alimentarias y respiratorias. El diagnóstico convencional se basa en la historia clínica, las pruebas cutáneas de punción y la medición de la IgE sérica específica para alérgenos frente a extractos completos de alérgenos. El diagnóstico de alergia basado en técnicas moleculares, también llamado diagnóstico resuelto por componentes, mide la IgE frente a moléculas individuales de alérgenos en lugar de solo frente a extractos. Esto puede ayudar a distinguir la sensibilización genuina de la reactividad cruzada, refinar la evaluación del riesgo clínico en algunas alergias y respaldar las decisiones sobre la inmunoterapia con alérgenos. Las plataformas multiplex, como Allergy Explorer (ALEX), pueden analizar la reactividad de la IgE frente a muchos extractos de alérgenos y componentes moleculares en un solo ensayo. El diagnóstico molecular de precisión para alergias (PAMD®) es un enfoque diagnóstico más amplio que utiliza perfiles moleculares de IgE para guiar el pronóstico, la evaluación del riesgo y el manejo personalizado, aunque los resultados deben interpretarse junto con la historia clínica del paciente. [ 59 ]

Véase también

Referencias

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