NOMe-seq

La secuenciación de ocupación de nucleosomas y metilación ( NOMe -seq ) es una técnica genómica que se utiliza para detectar simultáneamente el posicionamiento de los nucleosomas y la metilación del ADN . ^{[ 1 ]} Este método es una extensión de la secuenciación con bisulfito , considerada el estándar de oro para el perfilado de la metilación del ADN. ^{[ 2 ]} NOMe-seq se basa en la metiltransferasa M.CviPl, que metila las citosinas en los dinucleótidos GpC no unidos a nucleosomas u otras proteínas , creando una huella de nucleosoma. El genoma de los mamíferos contiene metilación del ADN de forma natural, pero solo en los sitios CpG , por lo que la metilación de GpC se puede diferenciar de la metilación genómica después de la secuenciación con bisulfito. Esto permite el análisis simultáneo de la huella de nucleosoma y la metilación endógena en las mismas moléculas de ADN . ^{[ 1 ]} Además del análisis de huellas de nucleosomas, NOMe-seq puede determinar las ubicaciones a las que se unen los factores de transcripción . Los nucleosomas se unen a 147 pares de bases de ADN ^{[ 3 ]} mientras que los factores de transcripción u otras proteínas solo se unen a una región de aproximadamente 10-80 pares de bases. Tras el tratamiento con M.CviPl, los sitios de nucleosomas y factores de transcripción se pueden diferenciar en función del tamaño de la región GpC no metilada. ^{[ 4 ]}

La ocupación de nucleosomas determina la accesibilidad del ADN, lo que proporciona información sobre las regiones reguladoras del genoma. Los elementos reguladores importantes dentro de una célula (como promotores , potenciadores , silenciadores , etc.) se encuentran en regiones abiertas o accesibles para permitir la unión de factores de transcripción u otras moléculas reguladoras. ^{[ 3 ]} Por lo tanto, NOMe-seq puede utilizarse para dilucidar información reguladora. Las técnicas alternativas de accesibilidad del ADN incluyen MNase-seq , ^{[ 5 ]} DNase-seq , ^{[ 6 ]} FAIRE-seq , ^{[ 7 ]} y su sucesor ATAC-seq . ^{[ 8 ]} NOMe-seq tiene el beneficio adicional de proporcionar el estado de metilación del ADN, que también desempeña un papel crucial en la regulación de la actividad genómica. Curiosamente, el aumento de la metilación del ADN se asocia con el silenciamiento transcripcional, mientras que el ADN accesible no unido a nucleosomas se asocia generalmente con la activación transcripcional. En este sentido, NOMe-seq consiste en dos análisis de metilación independientes que son funcionalmente opuestos. ^{[ 9 ]}

La metiltransferasa M.CviPl se describió por primera vez en 1998, cuando el gen se clonó del virus Chorella NYs-1. ^{[ 10 ]} Después de su descubrimiento, la metiltransferasa se utilizó para la huella de nucleosomas ya en 2004, ^{[ 11 ]} pero NOMe-seq no se describió oficialmente hasta 2012. ^{[ 12 ]} M.CviPl no fue la única metiltransferasa utilizada para la huella de nucleosomas; el análisis de promotor único sensible a la metilasa (M-SPA) se describió en 2005 utilizando la metiltransferasa CpG M.Sssi. ^{[ 13 ] [ 14 ]} Las técnicas de M.CviPl superaron rápidamente a M-SPA ya que la especificidad GpC es preferible a la especificidad CpG, con los dinucleótidos GpC teniendo una distribución más amplia en todo el genoma y sin metilación endógena. ^{[ 14 ]} Posteriormente se desarrolló el ensayo NOMe-seq, cuya primera mención data de 2011 ^{[ 15 ]} y cuya descripción detallada se publicó en 2012. ^{[ 12 ]} Desde entonces, la técnica se ha adaptado a tecnologías de células individuales, describiéndose el NOMe-seq de células individuales (scNOMe-seq) en 2017 ^{[ 16 ]} y el NOMe-seq mediante secuenciación de nanoporos (nanoNOMe) en 2020. ^{[ 17 ]} Estas adaptaciones han permitido realizar análisis de alta resolución que pueden comparar y contrastar la accesibilidad del ADN entre células individuales. ^{[ 16 ]}

Componentes ^{[ 9 ]}

• Para aislar los núcleos, los componentes incluyen solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), tripsina o dispasa (según el tipo de célula), azul de tripano , hemocitómetro, tampón de lisis y tampón de lavado.
• Para tratar los núcleos con M.CviPl, los componentes incluyen tampón GpC, S-adenosilhomocisteína (SAM), M.CviPl, sacarosa, agua libre de nucleasas y tampón de parada.
• Para aislar el ADN tratado con M.CviPl, los componentes incluyen NaCl, proteinasa K , fenol:cloroformo (1:1), etanol, tampón TE y espectrofotómetro Nandrop EDTA pH 8
• Para la fragmentación del ADN tratado con M.CviPI, los componentes incluyen un sonicador Covaris, un tubo Covaris MicroTUBE AFA con tapa de corte previo de 6x16 mm, un espectrofotómetro Nanodrop y un kit de alta sensibilidad para ADN (Agilent) para usar con el bioanalizador Agilent 2100.
• Para la conversión con bisulfito del ADN tratado con M.CviPI, los componentes incluyen el kit de metilación de ADN EZ.
• Para la construcción de la biblioteca NOMe-seq, los componentes incluyen el kit de biblioteca de ADN Accel-NGS Methyl-Seq para plataformas Illumina, el kit de indexación Methyl-Seq Set A, perlas magnéticas, el kit de ensayo dsDNA HS y el kit de ADN de alta sensibilidad.

Flujo de trabajo ^{[ 1 ] [ 9 ]}

• Aislamiento de núcleos : lisis de células sedimentadas
• Tratar los núcleos con M. CviPl para metilar los GpC : Incubación con tampón GpC y M.CviPl
• Purificar y fragmentar los núcleos tratados con MCviPl.
• Tratar los núcleos tratados con MCviPI con bisulfito : Conversión de Cs no metiladas a Ts
• Construir la biblioteca NOME-seq
• Biblioteca de secuencias NOMe-seq
• Realizar control de calidad : Análisis de la secuencia mediante la alineación de los clones genómicos secuenciados con la secuencia convertida con bisulfito.
• Postprocesamiento : Análisis de duplicados y calidad de la cobertura
• Análisis de metilación : CpG se encuentra en todos los trinucleótidos HCG; GpC se encuentra en todos los trinucleótidos GCH.

• Poro-C