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Edición genómica fuera de objetivo

La edición genómica fuera de objetivo se refiere a modificaciones genéticas no específicas e involuntarias que pueden surgir mediante el uso de tecnologías de nucleasas modifica...

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La edición genómica fuera de objetivo se refiere a modificaciones genéticas no específicas e involuntarias que pueden surgir mediante el uso de tecnologías de nucleasas modificadas , tales como: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, espaciadas regularmente ( CRISPR ) -Cas9 , nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción ( TALEN ), meganucleasas y nucleasas de dedos de zinc (ZFN). [ 1 ] Estas herramientas utilizan diferentes mecanismos para unirse a una secuencia de ADN predeterminada ("objetivo"), la cual cortan, creando una rotura cromosómica de doble cadena (DSB) que activa los mecanismos de reparación del ADN de la célula (unión de extremos no homólogos ( NHEJ ) y recombinación homóloga ( HR )) y conduce a modificaciones específicas del sitio. [ 2 ] Si estos complejos no se unen al objetivo, a menudo como resultado de secuencias homólogas y/o tolerancia a desajustes, cortarán DSB fuera de objetivo y causarán modificaciones genéticas no específicas. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] Específicamente, los efectos fuera de objetivo consisten en mutaciones puntuales no deseadas , [ 6 ] deleciones , [ 7 ] [ 8 ] inserciones, [ 5 ] inversiones, [ 5 ] y translocaciones . [ 9 ] [ 8 ]

Los sistemas de nucleasas de diseño como CRISPR-Cas9 se están convirtiendo en herramientas de investigación cada vez más populares debido a su simplicidad, escalabilidad y asequibilidad. [ 10 ] [ 11 ] Dicho esto, las modificaciones genéticas fuera de objetivo son frecuentes y pueden alterar la función de genes que de otro modo estarían intactos. Múltiples estudios que utilizaron los primeros agentes CRISPR-Cas9 encontraron que más del 50% de las mutaciones inducidas por endonucleasas guiadas por ARN no ocurrían en el objetivo. [ 3 ] [ 7 ] El ARN guía (ARNg) de Cas9 reconoce una secuencia de ADN objetivo de 20 pb, a la que se une y corta para "editar" la secuencia de ADN. Sin embargo, la unión a la secuencia objetivo puede tolerar desajustes de hasta varios pares de bases, lo que significa que a menudo hay miles de posibles sitios de unión que presentan varias preocupaciones experimentales y de seguridad. [ 12 ] [ 3 ] En el ámbito de la investigación, los efectos fuera de objetivo pueden confundir variables en estudios biológicos, lo que lleva a resultados potencialmente engañosos y no reproducibles. [ 2 ] En el ámbito clínico, las principales preocupaciones giran en torno a la alteración de regiones codificantes vitales que conducen a efectos genotóxicos como el cáncer. [ 13 ] En consecuencia, la mejora de la especificidad [ 14 ] [ 15 ] de las herramientas de edición del genoma y la detección [ 9 ] [ 16 ] de efectos fuera de objetivo son áreas de investigación que progresan rápidamente. Dicha investigación incorpora el desarrollo [ 17 ] y el descubrimiento de nucleasas de diseño, [ 18 ] programas y bases de datos de predicción computacional, [ 19 ] [ 20 ] y secuenciación de alto rendimiento [ 9 ] [ 16 ] para reducir y anticipar la aparición de mutaciones. Muchas herramientas de nucleasas de diseño todavía están en su etapa inicial y, a medida que se comprendan mejor sus propiedades moleculares y comportamientos in vivo , serán cada vez más precisas y predecibles.

Mecanismos

El sistema CRISPR-Cas9 funciona como el sistema inmunitario adaptativo en bacterias y arqueas. [ 21 ] Cuando un virus infecta a las bacterias, este sistema incorpora segmentos del ADN viral al genoma bacteriano . Tras una segunda invasión, los transcritos de estas secuencias dirigen una actividad nucleasa a su secuencia complementaria en el virus invasor para destruirlo. [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ]

Para extrapolar este método a eucariotas y desarrollar un método de edición genética, se requieren una proteína Cas9, un ARN de secuencia de reconocimiento y un ARN transactivador. La fusión del ARN CRISPR de especificidad de secuencia de reconocimiento (crRNA) y el ARN transactivador (tracrRNA) se usa comúnmente en experimentos y se denomina ARN guía simple (sgRNA). [ 25 ] Este realiza ambas funciones: los primeros 20 nucleótidos del sgRNA son complementarios a la secuencia diana de ADN (función cr), mientras que los nucleótidos siguientes forman parte de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM; función tracr). [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]

La unión de nucleasas fuera de objetivo se origina a partir de una coincidencia parcial pero suficiente con la secuencia objetivo. Los mecanismos de unión fuera de objetivo se pueden agrupar en dos formas principales: tolerancia a la discrepancia de bases y discrepancia de abultamiento. [ 29 ]

tolerancia de desajuste de bases

Aunque se cree que la especificidad de Cas9 está controlada por el sgRNA de 20 nt y el PAM, las mutaciones fuera de objetivo siguen siendo frecuentes y podrían ocurrir con hasta 3-5 desajustes de pares de bases (de 20) entre el sgRNA y la secuencia de ADN objetivo. [ 25 ] [ 30 ] Además, las estructuras secundarias del sgRNA también podrían afectar la escisión de sitios objetivo y fuera de objetivo. Como se mencionó anteriormente, el sgRNA consta de una secuencia (~20 nt) que es complementaria a las secuencias objetivo y esta es seguida por una secuencia PAM que activa la actividad endonucleasa . Aunque se demostró que 10-12 nt adyacentes al PAM (llamado "secuencia semilla") eran suficientes para la especificidad de Cas9, Wu et al. demostraron que en un Cas9 catalíticamente inactivo solo se requieren 1-5 pares de bases de la secuencia semilla para la especificidad. [ 31 ] Esto fue demostrado posteriormente por otros estudios también. La unión de la proteína Cas9 se ve afectada además por una serie de mecanismos:

  • La secuencia semilla determina la frecuencia de una secuencia semilla más una secuencia PAM en el genoma y controla la concentración efectiva del complejo Cas9 sgRNA.
  • Es probable que las semillas ricas en uracilo tengan niveles bajos de sgRNA y aumenten la especificidad, ya que múltiples uracilos en la secuencia pueden introducir la terminación de la transcripción del sgRNA . [ 31 ] [ 32 ]
  • Las discrepancias en el extremo 5' del crRNA se toleran mejor, ya que el sitio importante estaría adyacente a la matriz PAM. También se toleran discrepancias simples y dobles, dependiendo de su ubicación.
  • En un estudio reciente, Ren et al. observaron una relación entre la eficiencia de la mutagénesis y el contenido de GC del sgRNA. Se requieren al menos 4-6 pb adyacentes al PAM para una buena edición. [ 33 ]
  • Al seleccionar un gRNA, se prefiere la guanina sobre la citosina como primera base de la semilla adyacente al PAM, la citosina como primera en el extremo 5' y la adenina en el medio de la secuencia. Este diseño se basa en la estabilidad vinculada a la formación de G quadruplexes . [ 31 ] [ 32 ] [ 34 ]
  • Kim et al. realizaron un ChIP que demostró que la adición de una Cas9 purificada junto con el sgRNA causó bajos efectos fuera de objetivo, lo que significa que hay más factores que causan estos efectos. [ 35 ]

Es importante destacar que la metilación del ADN en los sitios CpG reduce la eficiencia de la unión de Cas9 y otros factores en las células. Por lo tanto, existe un vínculo epigenético que se explorará con mayor profundidad en el futuro de la edición del epigenoma. [ 36 ]

Explicación gráfica del abultamiento del ADN y el ARN.

Las variaciones dentro de la secuencia PAM también pueden afectar la actividad del sgRNA, afectando a su vez al propio sgRNA. En los sistemas Cas9 de uso común, el motivo PAM es 5' NGG 3', donde N representa cualquiera de los cuatro nucleótidos del ADN. El requisito de la secuencia PAM puede causar problemas de especificidad, ya que algunas regiones tendrán una secuencia diana disponible para realizar la modificación genética deseada. Un informe indicó que el 99,96 % de los sitios que antes se consideraban dianas únicas de Cas9 en exones humanos podrían tener posibles efectos fuera de diana que contienen PAM NAG o NGG y un desajuste de una sola base en la secuencia semilla. [ 37 ]

Desajuste de abultamiento

Tanto los sitios fuera del objetivo con bases faltantes (o deleciones) como los sitios fuera del objetivo con bases adicionales (o inserciones), denominados respectivamente abultamiento de ARN y abultamiento de ADN, afectan la especificidad y la actividad de escisión de Cas9. Lin et al. imitaron estos abultamientos agregando y eliminando bases de la secuencia de sgRNA de tal manera que una deleción de base en el sgRNA produciría un abultamiento de ARN y una inserción de base produciría un abultamiento de ADN. [ 7 ] Al estudiar las tasas de mutación a través de NHEJ, llegaron a los siguientes resultados:

  • En el caso de protuberancias de ADN puras, las mutaciones fueron bien toleradas (es decir, la actividad de corte de Cas9 seguía siendo predominante). Las regiones de tolerancia a las protuberancias incluían siete bases del PAM y los extremos 5' y 3' de la secuencia semilla. Esto dio como resultado mutaciones similares o ligeramente superiores (en algunos casos) en comparación con la ausencia de protuberancias.
  • En el caso de protuberancias de ARN puro, se indujo una mayor actividad de Cas9 en muchas posiciones en comparación con las protuberancias de ADN. Esta característica se atribuyó al hecho de que el ARN es más flexible que el ADN y, por lo tanto, tiene una menor penalización de unión con la protuberancia de ARN, lo que resulta en una mayor tolerancia y un mayor número de mutaciones fuera del objetivo. [ 38 ]
  • Un mayor contenido de GC en la secuencia de sgRNA dio como resultado una mayor tolerancia y, por lo tanto, una mayor tasa de mutación fuera del objetivo.
  • Sorprendentemente, las protuberancias de 2 pb a 5 pb resultaron ser más tolerantes e inductoras de mutaciones que una sola protuberancia de 2 pb.

mejoras

Representación visual de CRISPR-Cas9 utilizando una nucleasa SpCas9 de tipo silvestre.
Mejoras de ingeniería de CRISPR-Cas9 que reducen los efectos fuera del objetivo mediante i) la colocalización (Cas9 nickasas) y ii) la dimerización (Fok1-dCas9).

Métodos para aumentar la especificidad

La nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9), ampliamente utilizada, es eficaz; sin embargo, induce mutaciones no deseadas fuera de objetivo con alta frecuencia. Se han descrito varios métodos de ingeniería y cribado para reducir las mutaciones fuera de objetivo en todo el genoma, incluyendo la mutación de la nucleasa, la modificación de la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM), el truncamiento del ARN guía (ARNg) y el descubrimiento de nuevas nucleasas. [ 39 ] Por ejemplo, en 2013, Fu et al. informaron que al truncar el ARNg de <20 pb de longitud a 17 o 18 pb, la especificidad de la nucleasa aumentó hasta 5000 veces y las desadaptaciones de más de 3 bases rara vez, o nunca, ocurrieron. [ 14 ]

nickasas Cas9

La nucleasa spCas9 también puede mutarse de diversas maneras para mejorar la especificidad y el control. Los dominios de nucleasa pueden mutarse independientemente entre sí para formar lo que se conoce como nickasas Cas9 . Estas nucleasas tienen un dominio de nucleasa activo e inactivo que dan como resultado un complejo que realiza la escisión de cadena simple. [ 4 ] Las nickasas Cas9 pueden emplearse en tándem (conocidas como nickasas apareadas), que realizan dos "cortes" de cadena simple en cadenas alternas. [ 4 ] Usando esta estrategia, ambas nickasas Cas9 deben colocalizarse, unirse y escindir su objetivo, lo que reduce drásticamente la probabilidad de indels fuera del objetivo . [ 4 ] Además, las DSB escindidas por las nickasas apareadas tienen extremos largos en lugar de extremos romos, lo que proporciona un mejor control de las inserciones dirigidas.

Fok1-dCas9 y nucleasas de dimerización

Como las nucleasas monoméricas suelen implicar altos niveles de efectos fuera de objetivo, la dimerización es una estrategia atractiva. En un sistema de dímero, ambas nucleasas deben unirse a sus objetivos individuales o "semisitios" y luego interactuar y dimerizarse para iniciar la escisión, lo que disminuye considerablemente la probabilidad de efectos fuera de objetivo. Se ha desarrollado un método que incorpora la fiabilidad de los dominios de nucleasa FokI dependientes de la dimerización , utilizados en ZFN y TALEN, con la simplicidad de CRISPR-Cas9. [ 17 ] La nucleasa FokI se encontró originalmente en Flavobacterium okeanokoites y solo escinde el ADN si se activa mediante dimerización. Básicamente, los investigadores fusionaron esta nucleasa a un complejo CRISPR con una nucleasa Cas9 inactiva (Fok1-dCas9). [ 17 ] El ARN guía dirige el complejo CRISPR al sitio objetivo, pero el "corte" lo realiza Fok1 dimerizado. Se estima que la estrategia Fok1-dCas9 reduce los efectos fuera de objetivo detectables en 10 000 veces, lo que la hace eficaz para aplicaciones que requieren una edición genómica altamente precisa y específica. [ 17 ] [ 40 ]

Mutación de nucleasa

Además de un ARN guía, Cas9 requiere la unión a una secuencia PAM específica de 2 a 6 nucleótidos. En los sistemas SpCas9 de uso común, el motivo PAM es 5' NGG 3', donde N representa cualquiera de los cuatro nucleótidos del ADN. El requisito de la secuencia PAM puede causar limitaciones de especificidad, ya que algunas regiones no tendrán una secuencia objetivo disponible para realizar la modificación genética deseada. La secuencia PAM se puede editar a motivos no canónicos NAG y NGA, lo que no solo mejora la especificidad, sino que también reduce los efectos fuera de objetivo. [ 41 ] Una mutación D1135E parece alterar las especificidades de PAM. La mutación D1135E reduce los efectos fuera de objetivo y aumenta la especificidad de SpCas9. [ 41 ] Una variante adicional, SpCas9-HF1 , también produce mejoras favorables en la especificidad de Cas9. [ 42 ] Se han identificado varias combinaciones de sustituciones conocidas por formar contactos de ADN no específicos (N497A, R661A, Q695A y Q926A). [ 42 ] Una sustitución cuádruple de estos residuos (posteriormente denominada SpCas9-HF1) presenta niveles extremadamente bajos de efectos fuera de objetivo, según lo detectado por experimentos GUIDE-seq . [ 42 ] Variantes como SpCas9-HF1 y D1135E, y otras similares, pueden combinarse, probarse y añadirse fácilmente a los vectores SpCas9 existentes para reducir las tasas de mutaciones fuera de objetivo. Además, muchas de las estrategias de ingeniería enumeradas anteriormente pueden combinarse para crear herramientas de edición de nucleasas guiadas por ARN cada vez más robustas y fiables. La evolución dirigida también puede utilizarse para reducir la actividad nucleasa en secuencias diana específicas, lo que da lugar a variantes como SpartaCas (que contiene las mutaciones D23A, T67L, Y128V y D1251G en relación con la SpCas9 de tipo silvestre). [ 43 ]

CRISPRi y CRISPRa

También se han desarrollado la interferencia CRISPR ( CRISPRi ) y la activación CRISPR ( CRISPRa ). [ 44 ] Estos sistemas pueden alterar con precisión la transcripción genética a nivel del ADN sin causar alteraciones genéticas irreversibles. [ 44 ] Además, al actuar directamente sobre el ADN, son generalmente más específicos y predecibles en comparación con el ARN de interferencia ( ARNi) . [ 45 ] Aunque CRISPRi/a no puede reemplazar la edición del genoma en todos los experimentos, puede actuar como una alternativa eficaz en algunos casos. CRISPRi y CRISPRa utilizan una enzima Cas9 desactivada (dCas9) que no puede cortar el ADN, pero puede administrar activadores y represores transcripcionales para modular la expresión génica deseada con alta precisión. [ 44 ] Actualmente, los efectos fuera de objetivo de CRISPRi son mínimos y muestran una respuesta y sensibilidad reducidas a los desajustes de una sola base. [ 44 ] Es importante destacar que, cuando inevitablemente ocurren efectos no específicos, estos son reversibles, dependientes del tiempo y menos dañinos que la edición de ADN, lo que los convierte en alternativas efectivas que pueden limitar la carga de efectos fuera de objetivo cuando sea posible. CRISPR-Cas13b , que utiliza un sistema CRISPR-Cas de tipo IV (a diferencia del tipo II comúnmente utilizado), puede dirigirse a secuencias de ARN específicas y editarlas. [ 46 ] Dicha plataforma de edición de ARN tiene la capacidad de editar específicamente el ARNm y, por lo tanto, la traducción de proteínas, sin alterar el ADN. Esto representa una tecnología prometedora que, de tener éxito, reduciría la carga de mutaciones irreversibles fuera de objetivo.

Detección

Aunque se tomen medidas cuidadosas para evitar mutaciones no deseadas, e incluso si se logra, es necesario realizar una prueba de confirmación para detectar mutaciones no deseadas. Actualmente existen numerosos métodos, tanto sesgados como imparciales, para dicha prueba, y solo dos métodos in vitro . Todos ellos se enumeran a continuación:

Secuenciación dirigida, del exoma y del genoma completo

En el caso de la secuenciación dirigida normal, el enfoque sesgado solo arrojará resultados para el área de captura prevista, lo que dificulta la búsqueda, ya que no aparecerán mutaciones inesperadas en la pantalla. Si bien es fácil y económico, se vuelve laborioso y costoso una vez que se agregan más sitios objetivo. La secuenciación del exoma utiliza la captura del exoma para adquirir las regiones codificantes de proteínas del genoma. Es imparcial, sin embargo, no detectará mutaciones fuera del objetivo en la región no codificante del genoma. En el caso de la secuenciación del genoma completo , se analiza todo el genoma en busca de mutaciones fuera del objetivo. Actualmente, este método es costoso y, al igual que la secuenciación del exoma, también requiere un genoma de referencia para realizar inferencias. [ 47 ]

BENDECIR

Descripción general de diferentes métodos para la detección de mutaciones fuera de objetivo mediante edición genómica. A) BLESS B) GUIDE-seq C) HTGTS D) Digenome-Seq

BLESS es la forma más sencilla de detectar y cuantificar mutaciones fuera de objetivo mediante el cribado de roturas de doble cadena (DSB) en el genoma. Este método se basa en el enriquecimiento de marcaje directo in situ de roturas en estreptavidina. Desarrollado en 2013, [ 48 ] BLESS se realiza ligando los extremos de las DSB con biotina, es decir, biotinilización. A continuación, se separan/recolectan dichos extremos ligados utilizando estreptavidina. Se añade una secuencia vinculada a las secuencias biotiniladas y esta mezcla final se secuencia para obtener la posición de la mutación fuera de objetivo. Al ser imparcial, BLESS proporciona información sobre el sitio de la mutación dentro del genoma, en lugar de sobre las proteínas implicadas o asociadas a las DSB. Sin embargo, BLESS solo puede detectar mutaciones en el momento del experimento y no las que se formaron anteriormente y fueron reparadas. [ 49 ]

LAM-HTGTS

La secuenciación de translocación genómica de alto rendimiento mediada por amplificación lineal (LAM-HTGTS) es un método desarrollado para rastrear eventos de translocación causados ​​por la unión entre roturas de doble cadena (DSB). [ 50 ] Desarrollada para detectar mutaciones fuera de objetivo de TALEN y CRISPR-Cas9, esta técnica se basa en la reparación del ADN mediante la unión de extremos en las DSB. Una vez que se agrega la nucleasa, se producen mutaciones dentro y fuera del objetivo. Junto con esto, hay una secuencia cebo que también se corta. Por lo tanto, si ocurre otra DSB en un cromosoma distinto al cromosoma de la secuencia cebo, ambos se unen, lo que da lugar a una translocación. Dado que la secuencia cebo es conocida, esta secuencia translocada se amplifica con cebadores. En caso de que no haya translocación, hay un sitio de restricción dentro del cual se corta para evitar la amplificación únicamente de la secuencia cebo. El ADN amplificado se secuencia para estudiar grandes reordenamientos genómicos debidos a mutaciones fuera de objetivo. Una desventaja es que depende de la presencia simultánea del cebo y de otra barrera de sedimentos.

GUÍA-Secuencia

Otro método para detectar mutaciones fuera de objetivo causadas por la actividad de las nucleasas es GUIDE-Seq . GUIDE-seq, o Identificación Imparcial de Roturas de Doble Cadena en Todo el Genoma (Genome Wide Unbiased Identification of DSB Enabled by Sequencing), se basa en la incorporación de oligodesoxinucleótidos de doble cadena (dsODN) en las roturas de doble cadena mediante NHEJ. Su amplificación va seguida de la secuenciación. Dado que se utilizan dos cebadores para secuenciar los dsODN, se amplifican las regiones que flanquean la rotura de doble cadena junto con la propia rotura. Esto permite mapear la mutación fuera de objetivo. Esta técnica se ha aplicado para identificar todos los sitios fuera de objetivo previamente conocidos, así como otros nuevos con frecuencias tan bajas como el 0,03 %. Sin embargo, al igual que BLESS, GUIDE-seq solo puede detectar las roturas de doble cadena presentes en el momento del estudio.

Secuenciación de digenoma

Uno de los métodos in vitro actuales , Digenome-Seq, utiliza la propiedad de Cas9 de cortar el genoma para obtener un perfil imparcial de todo el genoma. En este método, se añade Cas9 al ADN genómico y se estudian los efectos posteriores mediante secuenciación de alto rendimiento. Dado que los fragmentos se forman debido a la misma nucleasa, los extremos de estos fragmentos se pueden mapear y alinear. Dos grandes ventajas son que se puede utilizar para estudiar hasta 10 ARN guía a la vez y puede identificar objetivos con frecuencias tan bajas como el 0,01 %. [ 9 ] Sin embargo, la principal ventaja es que este método es in vitro , es decir, las roturas de doble cadena introducidas por Cas9 no serán procesadas por la maquinaria de reparación del ADN (a diferencia de BLESS y GUIDE-seq) y, por lo tanto, incluirán todos los posibles mutantes fuera del objetivo. Sin embargo, también podría dar lugar a un gran número de falsos positivos. [ 51 ]

Secuenciación circular/secuenciación de cambios

La última incorporación a los métodos in vitro para detectar mutaciones fuera de objetivo es CIRCLE-seq. Con licencia de Beacon genomics (junto con GUIDE-seq), [ 52 ] CIRCLE-seq tiene como objetivo eliminar las desventajas de Digenome-seq, como la necesidad de un gran tamaño de muestra y profundidad de lectura (~400 millones de lecturas) y el alto ruido de fondo que dificulta la identificación de eventos de corte de baja frecuencia. [ 53 ] Adopta una estrategia independiente de enzimas de restricción para crear y seleccionar la conversión de ADN cortado aleatoriamente. Tras el corte, el ADN objetivo forma un bucle de tallo al que se pueden añadir adaptadores para la secuenciación. Si bien esto demostró ser posible, la otra posibilidad produjo una diferencia de detección mucho mayor. En el segundo caso, la secuencia se corta utilizando Cas9 y, cuando se corta de nuevo en el sitio de corte, se obtiene un corte circular (de ahí el nombre CIRCLE-seq). Casi todos los sitios identificados mediante circularización contienen tanto sitios lineales detectados como otros más recientes, lo que sugiere que CIRCLE-seq no presenta sesgos entre las rupturas y obtiene también rupturas fuertes de baja frecuencia. Además, ayuda a secuenciar el sitio de ruptura desde ambos lados de la escisión en comparación con otros métodos que solo tienen un lado de lectura. CHANGE-seq [ 54 ] es una versión más optimizada de CIRCLE-seq que utiliza una reacción de tagmentación en el paso de circularización, lo que requiere menos material de ADN y permite una investigación rápida de sitios fuera de objetivo.

BreakTag

BreakTag es un método in vitro que etiqueta las roturas de doble cadena de ADN libre con una ligación de un adaptador de ADN y una reacción de tagmentación [ 55 ] . El enriquecimiento de las roturas de ADN inducidas por nucleasas tiene lugar durante la amplificación por PCR, y el protocolo es más rápido que los métodos in vitro anteriores con un mayor rendimiento. BreakTag puede mapear tanto roturas de ADN romas como escalonadas, lo que permite investigar los diferentes patrones de escisión inducidos por la nucleasa Cas9. La escisión escalonada inducida por Cas9 está asociada con la formación de inserciones de ADN predecibles a través de NHEJ, con la secuencia del saliente 5' duplicada. El método también se puede aplicar para la investigación fuera de objetivo de Cas12 , que genera roturas escalonadas y no se pueden mapear con otros métodos como CIRCLE-seq y CHANGE-seq.

Bibliotecas de objetivos con código de barras

Las nucleasas como Cas9 también pueden ser desafiadas in vitro por bibliotecas aleatorias de objetivos. [ 56 ] La ligación de adaptadores para cuantificar los miembros de la biblioteca clivados y no clivados permite una medición imparcial del perfil de especificidad de una nucleasa. La medición del clivaje de bibliotecas de objetivos con código de barras (BLT) con SpCas9 indicó que los perfiles de especificidad eran específicos de la guía y dependían tanto de la secuencia de la guía como de la propia nucleasa. Los perfiles de especificidad imparciales basados ​​en cada complejo Cas9-gRNA particular pueden usarse para construir modelos predictivos específicos de la guía para el clivaje in vitro .

Significado

terapia génica

Para que las tecnologías de edición genética den el salto hacia un uso seguro y generalizado en la clínica, es necesario que la tasa de modificación fuera de objetivo se vuelva obsoleta. La seguridad del tratamiento de terapia génica es de suma importancia, especialmente durante los ensayos clínicos, donde las modificaciones fuera de objetivo pueden bloquear el desarrollo posterior de un producto candidato. [ 57 ] Quizás el ejemplo más conocido de terapia génica moderna sea la terapia CAR-T, que se utiliza para el tratamiento del linfoma de células B. Para limitar la tasa de corte fuera de objetivo, la terapia utiliza un TALEN altamente específico y finamente ajustado, que ha demostrado tener poca o ninguna interacción fuera de objetivo de fondo. [ 57 ] La inmunoterapia CAR-T es un procedimiento ex vivo , lo que significa que las células inmunitarias del paciente (en este caso, células T ) se extraen y editan utilizando nucleasas de diseño. [ 57 ] Si bien el desarrollo del sistema TALEN es costoso y requiere mucho tiempo, las modificaciones de investigación e ingeniería han limitado drásticamente su tasa de interacción fuera de objetivo. Sin embargo, los pacientes que reciben el tratamiento siguen siendo monitorizados con frecuencia y lo serán durante los próximos 15 años para que se puedan analizar los efectos fuera de objetivo y las respuestas inmunogénicas y tenerlos en cuenta a medida que se lleven nuevas terapias génicas a ensayos clínicos. [ 58 ]

Ensayos clínicos con células T auxiliares autólogas modificadas con ZFN y CCR5

Un ensayo clínico de fase I/II incluyó a 12 pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) para probar la seguridad y la eficacia de la administración de células T auxiliares autólogas modificadas con ZFN. [ 59 ] Mediante deleciones dirigidas, la ZFN personalizada desactiva el gen del receptor de quimiocina CC 5 ( CCR5 ), que codifica un correceptor que el virus del VIH utiliza para entrar en la célula. [ 60 ] Como resultado del alto grado de homología de secuencia entre los receptores de quimiocina CC, esta ZFN también escinde CCR2 , lo que provoca deleciones fuera de objetivo de ~15 kb y reordenamientos genómicos. [ 60 ] [ 61 ] Los impactos de estas modificaciones de CCR2 aún se desconocen y, hasta la fecha, no se han reportado efectos secundarios. Sin embargo, se sabe que CCR2 tiene muchas funciones críticas en los sistemas neuronales y metabólicos. [ 62 ] [ 63 ]

Impulsores genéticos

Actualmente se están probando sistemas de modificación genética mediante CRISPR-Cas9, los cuales se han propuesto como estrategias para eliminar especies invasoras y vectores de enfermedades. Al modificar genéticamente un organismo para que exprese una endonucleasa endógena específica de secuencia, se puede cortar una secuencia diana (como un gen de fertilidad) en el cromosoma opuesto. [ 64 ] Una rotura de doble cadena en la secuencia diana conduce a una reparación homóloga que, en la práctica, convierte al organismo en homocigoto para la secuencia diana deseada. Esta estrategia, conocida como sistema de homing drive, puede suprimir una población al afectar un gen crítico o inducir esterilidad recesiva. Sin embargo, si dicho sistema se liberara en la naturaleza, el sistema CRISPR-Cas9 permanecería funcional indefinidamente. Con cada generación posterior, las mutaciones fuera de la diana serían cada vez más probables y los efectos de estas mutaciones en una especie serían estocásticos. Las mutaciones fuera de la diana podrían desactivar las propiedades supresoras de un sistema de modificación genética, manteniendo al mismo tiempo la expresión de la endonucleasa. En tal situación habría un mayor riesgo de flujo genético entre la especie objetivo y otras especies, lo que probablemente conduciría a resultados no deseados. [ 65 ]

Controversia

El creciente uso de la edición genómica y su eventual aplicación clínica ha suscitado controversia en torno a la verdadera carga de efectos no deseados de estas tecnologías.

Schaefer y otros, 2017

El 30 de mayo de 2017, se publicó un artículo de correspondencia de dos páginas en Nature Methods que informaba de un número inusualmente alto de SNV e indels fuera de objetivo después de secuenciar ratones que habían participado previamente en un experimento de reparación genética in vivo . [ 66 ] El experimento anterior, realizado por el mismo grupo, restauró con éxito la visión de la cepa de ratones ciegos ( rd1 ) corrigiendo la mutación Y347X en el gen Pde6b utilizando un sistema CRISPR-Cas9. [ 67 ] Después de completar el experimento, se secuenció el genoma completo de dos ratones genéticamente corregidos y se comparó con los genomas de cepas de ratones de control y conocidas. Se descubrieron más de 1600 SNV y 128 indels, de los cuales 1397 SNV y 117 indels eran compartidos entre los dos ratones editados, lo que sugiere que los efectos fuera de objetivo no eran aleatorios. Los algoritmos que intentaban predecir la ubicación de estas mutaciones fuera de objetivo fallaron para la gran mayoría de los loci. En comparación, un estudio de secuenciación del exoma completo de 2016 encontró 19 SNV y 3 indels en 5 ratones editados, mientras que Schaefer et al. encontraron 115 SNV exónicos y 9 indels en solo 2 ratones editados. [ 68 ] Muchos expertos discreparon con el artículo y lo criticaron a través de artículos de revistas [ 68 ] y redes sociales, sugiriendo que se utilizaron tratamientos CRISPR inusuales en el artículo inicial y que el tamaño de la muestra era demasiado pequeño para ser significativo (n=2). Nature Methods ha emitido dos notas editoriales sobre el artículo, [ 69 ] y posteriormente lo retractó. [ 70 ] No obstante, se ha encontrado consistentemente que las tasas de efectos fuera de objetivo son más frecuentes in vivo en comparación con los experimentos de cultivo celular, y se cree que son particularmente comunes en humanos. [ 3 ] [ 7 ]

Referencias

  1. ↑ Costa JR, Bejcek BE, McGee JE, Fogel AI, Brimacombe KR, Ketteler R (2004). "Edición del genoma mediante nucleasas modificadas y su uso en el cribado genómico". En Sittampalam GS, Coussens NP, Brimacombe K, Grossman A, Arkin M, Auld D, et  al. (eds.). Manual de orientación para ensayos . Bethesda (MD): Eli Lilly & Company y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales. PMID 29165977 . 
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