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Articulo de referencia

Virus Y de la patata

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El virus Y de la papa (PVY) es un virus vegetal de la familia Potyviridae , [ 1 ] y uno de los virus vegetales más importantes que afectan la producción de papa .

La infección por PVY en plantas de papa produce diversos síntomas según la cepa viral . El síntoma más leve es la pérdida de producción, pero el más perjudicial es la enfermedad de la mancha anular necrótica del tubérculo de papa (PTNRD). Las manchas anulares necróticas hacen que las papas no sean comercializables y, por lo tanto, pueden ocasionar una pérdida significativa de ingresos. El PVY se transmite por áfidos , pero también puede permanecer latente en las papas de siembra. Esto significa que usar la misma línea de papa para la producción de papas de siembra durante varias generaciones consecutivas provocará un aumento progresivo de la carga viral y la consiguiente pérdida de la cosecha .

El aumento de la infección de plantas de papa con virus en los últimos años ha provocado pérdidas considerables para la industria sudafricana de la papa. El incremento de la tasa de infección puede atribuirse a varios factores, entre ellos una marcada disminución en la eficacia y la aplicación de los productos químicos utilizados para el control de vectores, el uso de papas de siembra infectadas en el cultivo, métodos de riego y cultivo incorrectos, así como la falta de un método de detección sensible, rápido y fiable. [ 2 ] El aumento de la temperatura media de los inviernos como consecuencia del calentamiento global también ha provocado un incremento en la población de pulgones, lo que a su vez ha conllevado un aumento en la propagación de virus. [ 2 ]

Huéspedes, cepas y síntomas

Papa que muestra la enfermedad de manchas anulares necróticas.

El PVY pertenece al género Potyvirus , el género más grande de virus vegetales y posiblemente el más destructivo en los cultivos de papa. [ 3 ] El género incluye más de 200 especies que causan pérdidas significativas en el ámbito agrícola. [ 4 ] El PVY infecta muchas especies vegetales de importancia económica. Estas incluyen la papa ( Solanum tuberosum ), el tabaco ( Nicotiana tabacum ), el tomate ( Solanum lycopersicum ) y el pimiento ( Capsicum spp.). [ 5 ] El nivel de daño al cultivo está determinado por la cepa de PVY que infecta las plantas, la carga viral, el momento en que ocurre la infección, así como la tolerancia que posee el huésped hacia el virus. [ 6 ] La resistencia a la infección por PVY por parte de los huéspedes es baja en muchos casos. La infección de un campo de papa con PVY puede resultar en una pérdida de rendimiento del 10 al 100 %. [ 6 ]

Se ha demostrado que el PVY tiene diferentes aislamientos según los síntomas que inducen en varias especies de plantas de papa. [ 7 ] La extensa variabilidad biológica, serológica y molecular de los aislamientos de PVY hace que la clasificación de los aislamientos como cepas particulares sea particularmente difícil. La aparición de una variedad de síntomas y el surgimiento del PVY NTN necrótico ha llevado a la búsqueda de herramientas de clasificación más confiables que la simple identificación serológica. Tradicionalmente se reconocen tres cepas principales de PVY: PVY C , PVY N y PVY O. PVY C , originalmente conocido como Virus de la Papa C, fue el primero en ser reconocido y fue identificado en la década de 1930. [ 8 ] PVY C induce respuestas hipersensibles en una amplia gama de cultivares de papa. Estas reacciones incluyen la formación de patrones de mosaico leves o estrías punteadas. A diferencia de las otras cepas de PVY, algunas cepas de PVY C no son transmisibles por áfidos. [ 9 ] Estudios previos de Visser et al. [ 10 ] no identificó ninguno de los aislados locales como PVY C , pero se ha informado que ocurre en papas en Sudáfrica. [ 11 ] [ 12 ] Una segunda cepa de PVY es PVY N. [ 13 ] Esta cepa fue descrita en plantas de tabaco que crecían cerca de plantas de papa. [ 14 ] PVY N produce necrosis de las hojas y daños leves o incluso ningún daño a los tubérculos. La cepa común de PVY se denomina PVY O. La infección de una planta de papa con la cepa PVY O produce daños leves en los tubérculos y no causa necrosis de las hojas. [ 15 ] Tanto PVY N como PVY O son transmisibles por pulgones y ocurren en Sudáfrica. En Europa se ha demostrado que estas dos cepas se han recombinado para formar PVY NTN . [ 16 ] [ 17 ] Se le ha atribuido a PVY NTN la capacidad de inducir la enfermedad de la mancha anular necrótica del tubérculo de papa (PTNRD). [ 16 ] Los tubérculos dañados por PTNRD se vuelven no comercializables y la infección por PVY NTN produce, por lo tanto, un mayor impacto económico que la infección por las otras cepas.

Transmisión

El PVY puede transmitirse a las plantas de papa a través del injerto , la inoculación de la savia de la planta y a través de la transmisión de pulgones . La forma más común de infección del material vegetal por PVY en el campo es a través del pulgón, y aunque los pulgones por sí solos pueden dañar directamente las plantas de papa, es su papel como vectores virales el que tiene el mayor impacto económico. [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] En climas fríos, los pulgones pasan el invierno como pulgones sin alas que dan a luz crías vivas (viviparas) o como huevos. Los huéspedes como las malas hierbas y otros cultivos sirven como zonas de reproducción para estos pulgones y forman un área de colonización temporal antes de que los pulgones migren a los campos de papa. [ 19 ] En climas moderados, como en Sudáfrica, se cree que los pulgones se reproducen asexualmente en malas hierbas, otros cultivos, plantas autóctonas y plantas de jardín. Esto significa que hay una cantidad de pulgones presentes durante todo el año. La importancia de un monitoreo efectivo y riguroso de las poblaciones de pulgones se destaca en una revisión de Radcliffe y Ragsdale (2002), ya que los viriones del PVY se introducen en los campos de papa casi exclusivamente por pulgones alados provenientes de una fuente de virus fuera de estos campos. Los pulgones sin alas aún no se han relacionado con la propagación del PVY en los campos de papa. [ 21 ]

Se ha descubierto que el pulgón verde del melocotonero ( Myzus persicae ) es el más eficaz en su función como vector viral, [ 6 ] [ 18 ] [ 22 ] pero otros como Aphis fabae , Aphis gossypii , Aphis nasturtii , Macrosiphum euphorbiae , Myzus (Nectarosiphon) certus , Myzus (Phorodon) humuli y Rhopalosiphum insertum también están fuertemente asociados con la transmisión viral. [ 18 ] [ 22 ] El Consejo de Investigación Agrícola-Instituto de Plantas Hortícolas y Ornamentales (ARC-VOPI) 6 de Sudáfrica identificó veinticinco especies de pulgones capaces de funcionar como vectores de PVY. [ 23 ] También se establecieron las eficiencias de algunos de estos pulgones para funcionar como vectores de PVY (Ragsdale et al., 2001) y se encontró que variaban entre las diferentes especies. En Sudáfrica, Aphis fabae , Aphis gossypii y Aphis nasturtii son los vectores de PVY más comunes y eficientes que se encuentran en el campo. [ 6 ] Además de ser clasificados según su eficiencia como vectores, los pulgones también pueden dividirse en dos subgrupos, a saber, especies colonizadoras y no colonizadoras. Los pulgones colonizadores son aquellos que se reproducen y se establecen específicamente en plantas de papa, mientras que los pulgones no colonizadores no se reproducen ni establecen colonias en plantas de papa. Los pulgones colonizadores están mejor adaptados a la vida en plantas de papa y, por lo tanto, generalmente se consideran mejores vectores de PVY que los pulgones no colonizadores. Los pulgones no colonizadores no se alimentan principalmente de plantas de papa, pero lo hacen ocasionalmente mientras buscan un huésped más adecuado. Su menor eficiencia como vector de PVY se compensa con la gran cantidad en la que se encuentran. [ 20 ] [ 24 ] Por este motivo, todos los pulgones presentes en los campos de patatas y sus alrededores deben considerarse como posibles vectores y su número debe ser monitoreado cuidadosamente.

La transmisión del PVY por los áfidos ocurre de manera no persistente y no circulativa, lo que sugiere una interacción menos íntima entre el virión y el vector que en el caso de los viriones circulativos. [ 25 ] El hecho de que los viriones se transmitan de manera no persistente significa que la replicación viral no ocurre dentro del áfido vector y que, a menos que el áfido se alimente de plantas infectadas, pierde su capacidad de infectar plantas después de dos o tres alimentaciones. [ 6 ] [ 26 ] Los viriones se adhieren al estilete del áfido en cuestión de segundos y pueden permanecer infecciosos durante cuatro a diecisiete horas. [ 27 ] [ 28 ] La distancia a la que se pueden transmitir los viriones es limitada debido al corto período durante el cual permanecen infecciosos. [ 24 ] Aunque la corta vida fuera de las plantas inhibe la transmisión viral a larga distancia, no reduce la eficiencia de transmisión otorgada por la rápida tasa de adquisición e inoculación viral dentro de un campo.

Al entrar en la célula vegetal, la proteína de la cubierta del virus se desensambla y libera su genoma de ARN . El ARN viral actúa como ARNm , y aunque se sabe poco sobre su traducción, se cree que la región no codificante 5' funciona como un potenciador de la traducción. [ 29 ] El ARNm traducido da como resultado una poliproteína que se procesa en proteínas maduras. Cada poliproteína se escinde en diez proteínas diferentes que se cree que son multifuncionales. Estas proteínas, junto con las proteínas del huésped, se ensamblan para formar un complejo de replicación. Este complejo realiza la síntesis de ARN de cadena negativa , utilizando la cadena positiva del ARN viral como plantilla. Una vez que se han producido las copias adicionales de ARN, codifican para la síntesis de varias proteínas, como se mencionó anteriormente, así como proteínas de la cubierta. Estas proteínas de la cubierta ahora envolverán los genomas recién formados para dar lugar a nuevos viriones . Se ha sugerido que el encapsulamiento de los viriones recién formados se inicia por la interacción de las proteínas de la cubierta con el extremo 5' y que la proteína de la cubierta se acumula hacia el extremo 3'. [ 30 ] Todo el proceso de replicación viral ocurre dentro del retículo endoplasmático . Estas partículas virales recién sintetizadas son posteriormente transportadas a través de los plasmodesmos a las células vegetales adyacentes mediante varias proteínas auxiliares del potyvirus. La distribución de los virus dentro de la planta ocurre de acuerdo con la relación fuente-sumidero entre los tejidos en maduración y crecimiento. [ 31 ] La concentración de virus en toda la planta es alta y esto aumenta considerablemente la probabilidad de que los áfidos los absorban. La infección de las plantas por potyvirus puede presentar diversos síntomas. La infección puede incluir necrosis de las nervaduras, síntomas de mosaico y malformación de las hojas (Boonham et al., 2002). Las plantas infectadas que no muestran síntomas pueden tener copas infectadas y producirán productos de menor calidad que sus contrapartes sanas.

Interacción papa – PVY NTN

Dado que el PVY NTN causa grandes pérdidas en la producción de papa, la investigación de la interacción entre la papa y el virus Y de la papa (PVY NTN) es importante. Los cultivares de papa sensibles responden a la inoculación con PVY NTN desarrollando síntomas típicos. En las hojas inoculadas, de 5 a 7 días después de la inoculación, se desarrollan manchas anulares cloróticas y necróticas. A medida que el virus se propaga por la planta, los síntomas sistémicos se desarrollan en las hojas no inoculadas. Diez días después de la inoculación, aparecen arrugas y clorosis en mosaico , lo que provoca una apariencia de palmera (caída de las hojas).

Los mecanismos de defensa viral de las plantas intentarán principalmente restringir el movimiento del virus. Si esto no funciona, las plantas pueden intentar inducir la muerte celular en el tejido infectado, impidiendo así la propagación de los viriones. [ 32 ] Aunque se desconoce el mecanismo preciso de inducción de la enfermedad por potyvirus en plantas, se sabe que estos virus causan una supresión significativa de la expresión génica del huésped durante la replicación viral. [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ]

Se estudiaron intensamente los cambios fisiológicos en las plantas de papa como respuesta a la infección por PVY NTN . En las primeras etapas de la infección, es decir, las primeras 12 horas, se demostró que los genes relacionados con la fotosíntesis , los genes involucrados en la percepción, la señalización y la respuesta de defensa se expresaban diferencialmente. [ 35 ] 24 h después de la inoculación, la cantidad de ácido salicílico aumentó. [ 36 ]

Una alteración en la expresión genética interrumpe la función celular normal de las células, lo que podría ser la causa de los síntomas físicos que muestra la planta. En el momento del desarrollo de los síntomas, la investigación sobre la interacción entre el cultivar de papa susceptible y PVY NTN mostró cambios en el nivel de citoquinina . [ 37 ] En hojas inoculadas que mostraban síntomas, se detectaron modificaciones en la estructura y el tamaño de los cloroplastos , [ 38 ] niveles más bajos de clorofila y actividad diferencial de peroxidasas solubles y unidas iónicamente . [ 39 ]

En etapas posteriores de la infección por PVY NTN , la concentración total de proteínas aumentó en el cultivar de papa sensible, mientras que no se observaron cambios tan pronunciados en los cultivares de papa tolerantes y moderadamente tolerantes. [ 40 ] Los estudios de expresión génica revelaron cambios en la expresión de genes para proteínas de choque térmico , catalasa , β-1,3-glucanasa y genes involucrados en la fotosíntesis. [ 34 ]

Descripción molecular

Los viriones de potyvirus consisten en estructuras filamentosas sin envoltura que miden entre 680 y 900 nm de longitud y entre 11 y 15 nm de ancho. [ 41 ] Morfológicamente, la cápside del potyvirus consta de aproximadamente 2000 copias de la proteína de la cubierta (CP). [ 31 ]

La cápside encapsula una sola hebra de ARN de sentido positivo de aproximadamente 10 kb de longitud, que posee una región terminal 5' no traducida (5'-NTR) y una cola de poli-A 3' . [ 42 ] [ 43 ] El genoma de sentido positivo contiene un único marco de lectura abierto extendido y actúa directamente como ARNm. La región 5'-NTR de 144 nucleótidos es particularmente rica en residuos de adenina y tiene muy pocos residuos de guanina . En lugar de una estructura de capuchón convencional, la región 5'-NTR está asociada a una proteína ligada al genoma viral ( VPg ), que se considera que actúa como potenciador de la transcripción. [ 29 ]

La secuencia líder 5' tiene un sitio de entrada ribosómica interna (IRES) y elementos reguladores de la traducción independientes de la caperuza (CIRE). [ 44 ] El IRES dirige la traducción independiente de la caperuza a través de un mecanismo similar al utilizado por los eucariotas. [ 45 ] El marco de lectura abierto extendido codifica una poliproteína de 350 kDa. Esta poliproteína es procesada proteolíticamente por proteasas virales (NIa, HC-Pro y P1) y sufre escisión co- y postraduccional para producir varias proteínas multifuncionales. Estos incluyen los siguientes: P1 (proteína P1), HCPro (proteinasa del componente auxiliar), P3 (proteína P3), 6K1 (proteína 1 de 6 kDa), CI (inclusión cilíndrica), 6K2 (proteína 2 de 6 kDa), VPg (proteína viral ligada al genoma), NIaPro (proteína de inclusión nuclear a, dominio de proteinasa), NIb (proteína de inclusión nuclear b) y CP (proteína de la cubierta). [ 31 ]

Diagnóstico y detección

ELISA

En el pasado, los cultivos se inspeccionaban visualmente para determinar si estaban libres de enfermedades. La inspección visual también se utilizaba como base para la certificación de semillas. La determinación del estado viral mediante inspección visual es increíblemente difícil, ya que los síntomas pueden estar enmascarados o la infección latente. [ 24 ] Como resultado, se introdujeron pruebas e inspecciones posteriores a la cosecha. Estas pruebas implicaban el cultivo de material previamente cosechado en invernaderos. Las plantas resultantes se inspeccionaban para obtener una estimación más precisa del estado viral. Si bien este método de detección ofrecía cierto grado de monitoreo de la presencia viral, era subjetivo y muy ineficaz. La detección mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA) de cultivos y patatas de siembra reemplazó la inspección visual a principios de la década de 1970. El uso de ELISA ofreció a los laboratorios de diagnóstico rutinario un método rápido, eficaz y sensible para la detección de una amplia gama de virus de la planta de patata.

La detección de patógenos mediante ELISA se basa en la interacción entre el antígeno y los anticuerpos específicos , y se ha convertido en un método popular y rentable de detección rutinaria. En un ELISA, la fase sólida se puede recubrir con la muestra de interés que contiene el antígeno . [ 46 ] La eficiencia con la que el antígeno se une a la fase sólida depende de la temperatura, el tiempo de exposición y la concentración. [ 46 ] Las fases sólidas utilizadas incluyen membranas de nitrocelulosa, papel, vidrio, agarosa y placas de microtitulación de poliestireno o cloruro de polivinilo. Las placas de microtitulación son la fase sólida más utilizada porque son fáciles de manipular, permiten la automatización y el análisis mediante lectores de placas de microtitulación. Una desventaja de estas placas es que son altamente absorbentes, lo que aumenta la incidencia de unión inespecífica de los componentes utilizados en el ELISA. La unión inespecífica a las placas se reduce mediante el uso de tampones que contienen proteínas como la caseína y detergentes no iónicos como el Tween 20. Después del recubrimiento, se elimina el exceso de muestra y la placa se trata normalmente con una solución que contiene caseína al 1%. Posteriormente, la fase sólida se trata con anticuerpos generados contra el antígeno de interés. Después de cada paso de incubación, la placa se lava con PBS que contiene Tween 20. Estos pasos de lavado tienen como objetivo eliminar cualquier componente unido de forma inespecífica. [ 47 ] Los componentes unidos de forma inespecífica se unen con menor fuerza que los unidos de forma específica. La detección se logra mediante la adición de un anticuerpo acoplado a una enzima o la adición y detección de un anticuerpo biotinilado. En un sistema que utiliza un anticuerpo acoplado a una enzima, la adición posterior de un sustrato apropiado da como resultado la formación de un color proporcional a la cantidad de antígeno. [ 47 ] Alternativamente, la placa se puede recubrir con anticuerpos seguido de la incubación con la muestra que se va a detectar. Esto, a su vez, se puede detectar como se describió anteriormente y se denomina ELISA de sándwich de doble anticuerpo (DAS). Sin embargo, ambos sistemas tienen la desventaja de que el acoplamiento de la enzima al anticuerpo puede dar lugar a un impedimento estérico que, a su vez, puede resultar en una pérdida de función del anticuerpo y/o la enzima. [ 48 ] Esto puede superarse mediante el uso de un puente biotina-avidina o biotina-estreptavidina. En este tipo de sistema biotinaLa molécula de biotina se acopla al anticuerpo. No influye en el funcionamiento de los anticuerpos y se detecta fácilmente mediante avidina o estreptavidina conjugadas a una enzima adecuada. La estreptavidina tiene una afinidad extremadamente alta por la biotina, lo que resulta en un grado de especificidad aún mayor que en un sistema en el que la enzima se acopla directamente al antígeno. Para determinar la presencia del antígeno, se añade un sustrato específico para la enzima utilizada. La enzima convierte el sustrato en un producto coloreado, cuya intensidad se correlaciona con la cantidad de anticuerpos unidos y, por lo tanto, con la cantidad de antígeno presente. El DAS-ELISA tiene la ventaja de aumentar la especificidad del ELISA y reducir la unión inespecífica. Por consiguiente, el principio del DAS-ELISA se emplea comúnmente en ELISA para la detección de patógenos vegetales en la savia de las plantas sin purificación previa del patógeno.

El ELISA se considera un método seguro, económico y rápido para la detección de virus vegetales. Su bajo costo y relativa simplicidad permiten su uso generalizado en el sector agrícola, donde se analizan miles de muestras al año. Sin embargo, los ELISA no son completamente infalibles. Los niveles de virus en los tubérculos de papa, analizados mediante ELISA para su uso como papas de siembra, suelen ser bajos durante su periodo de latencia. La detección de virus mediante ELISA en estas papas es difícil y los valores de absorbancia pueden caer por debajo del umbral establecido. Por esta razón, el análisis de los tubérculos de siembra se realiza en tubérculos en brotación en lugar de tubérculos en estado de latencia. Si bien esto proporciona lecturas más fiables que el análisis directo de los tubérculos, retrasa la certificación de las papas de siembra. [ 49 ] Otra desventaja de un método de detección inmunológica es que los cambios a nivel genético pueden influir en la inmunogenicidad del antígeno a detectar. En el caso de los virus de la papa, las mutaciones en el gen CP pueden provocar cambios conformacionales en la proteína CP, lo que reduce la eficacia de los anticuerpos producidos contra el virus previamente presente.

RT-PCR

La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se ha convertido en un método potente y eficaz para la detección de virus de la papa en material vegetal, incluso en papas en estado de latencia. Solo se requiere una pequeña cantidad de material vegetal para el análisis mediante RT-PCR. Según el protocolo descrito en esta tesis, 0,1 g de material vegetal son suficientes para 14 500 reacciones. Durante la RT-PCR, las secuencias de ARN diana específicas se amplifican exponencialmente en copias de ADN. Para ello, el ARN del virus debe transcribirse primero a ADN mediante una transcriptasa inversa. Esta polimerasa sintetiza una cadena de ADN utilizando el ARN como molde, lo que da como resultado un complejo ADN/ARN. Para la síntesis de una cadena de ADN a partir del ARN molde, solo se requiere el cebador inverso, ya que el ARN es una cadena simple orientada de 5' a 3'. Posteriormente, la cadena de ADN recién sintetizada se utiliza como molde para la PCR tradicional.

Existen diferentes tipos de transcriptasas inversas polimerasas para adaptarse a distintas necesidades y condiciones de reacción. Entre las enzimas transcriptasas inversas más utilizadas se encuentran AMV RT, SuperScript III, ImProm-II, Omniscript, Sensiscript y Tth RT. Al final de la etapa de transcripción inversa, la enzima polimerasa se activa por calor. También es posible que la transcriptasa inversa polimerasa y la ADN polimerasa sean la misma enzima, y ​​que esta solo requiera una etapa de activación de la ADN polimerasa después de la transcripción inversa. Un ejemplo de esta enzima es la polimerasa Tth. Esta enzima posee actividad tanto de transcriptasa inversa dependiente de ARN como de polimerasa dependiente de ADN. Sin embargo, el centro activo de la ADN polimerasa está cubierto por oligonucleótidos específicos , denominados aptámeros . A temperaturas inferiores a la temperatura de reacción óptima, el componente de la ADN polimerasa dependiente de Tth permanece cubierto por los aptámeros. A estas temperaturas, la enzima Tth solo sintetiza una copia de ADN del molde de ARN. Una vez que la temperatura de reacción se eleva a 95  °C, los aptámeros se eliminan y el componente de la ADN polimerasa dependiente de ADN comienza a amplificar la secuencia diana.

La amplificación por PCR del ADN diana se produce en tres pasos: desnaturalización , hibridación y extensión. [ 47 ] Cada uno de estos pasos se lleva a cabo a una temperatura específica durante un período de tiempo fijo. La desnaturalización normalmente se realiza entre 90 y 95  °C y provoca la disociación de las cadenas de ADN. Después, la reacción se enfría a entre 40 y 70  °C para permitir que los cebadores se asocien con sus respectivas secuencias diana. Este paso se conoce como hibridación y es específico para cada cebador. La temperatura a la que se hibridan los cebadores es crítica. Temperaturas demasiado altas impedirían que los cebadores se asociaran con el ADN, lo que resultaría en una amplificación nula o deficiente. Temperaturas de hibridación demasiado bajas conducirían a la unión no específica de los cebadores y a una amplificación no específica. [ 47 ] Los cebadores unidos a las regiones que flanquean el ADN diana proporcionan grupos 3'-hidroxilo para la extensión catalizada por la ADN polimerasa. La ADN polimerasa más utilizada es la Taq , una enzima termoestable aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus . La ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN a lo largo de las cadenas molde, utilizando los cebadores como puntos de partida. Durante la etapa de extensión, las cadenas se amplifican más allá del ADN diana. Esto significa que cada cadena de ADN recién sintetizada tendrá una región complementaria a un cebador. Se produce un aumento exponencial en la cantidad de ADN a medida que los tres pasos mencionados se repiten cíclicamente. En una PCR tradicional, estos pasos pueden repetirse entre 20 y 55 veces. Sin embargo, un problema de la amplificación por PCR es que la temperatura necesaria para la disociación de las cadenas de ADN también provoca la desnaturalización de la ADN polimerasa. Esto se supera parcialmente mediante la bioingeniería de polimerasas más termoestables y con vidas medias más largas.

Aunque la RT-PCR es técnicamente más difícil de realizar y más cara que la ELISA, tiene la capacidad de permitir la detección de cargas virales bajas. Se considera que la RT-PCR es de 102 a 105 veces más sensible que la ELISA tradicional. [ 50 ] La RT-PCR también permite la detección de varios objetivos virales en la misma reacción mediante el uso de varias combinaciones de cebadores. Esto se llama multiplexación. Aunque la multiplexación es técnicamente más exigente que una reacción simple tradicional, permite un mayor rendimiento, ya que una sola muestra puede analizarse para varias cepas virales en una sola reacción. Los cebadores utilizados para la multiplexación se eligen de tal manera que dan como resultado amplicones de varios tamaños. Esto permite el análisis posterior a la RT-PCR mediante electroforesis en gel. Aunque la RT-PCR ahorra tiempo, permite la multiplexación y es más sensible que la ELISA, los reactivos y la instrumentación necesarios son caros y requieren un mayor nivel de experiencia técnica. Además, el análisis del producto final mediante electroforesis en gel es laborioso, relativamente más caro, requiere mucho tiempo y no se presta a la automatización. Por estas razones, el uso de RT-PCR para el análisis rutinario no es viable y no ha reemplazado a ELISA. Sin embargo, ofrece a la industria la oportunidad de analizar casos límite, especialmente en la certificación de la patata de siembra.

PCR cuantitativa

En la mayoría de las PCR tradicionales, los productos resultantes se analizan una vez finalizada la reacción. Este análisis se denomina análisis de punto final y suele ser cualitativo, en lugar de cuantitativo. Para este tipo de análisis, los productos se analizan principalmente en un gel de agarosa y se visualizan mediante bromuro de etidio como colorante fluorescente . No es posible establecer una correlación directa entre la intensidad de la señal y la concentración inicial de la muestra mediante el análisis de punto final, ya que la eficiencia de la PCR disminuye a medida que la reacción se acerca a la fase de meseta. Sin embargo, la PCR cuantitativa ofrece una alternativa precisa y rápida a la PCR tradicional. La PCR cuantitativa permite al investigador amplificar y analizar el producto en un solo tubo utilizando colorantes fluorescentes. Esto se conoce como PCR homogénea. Durante una PCR cuantitativa, el aumento de la fluorescencia se correlaciona con el aumento del producto. Mediante el uso de diferentes colorantes específicos, la PCR cuantitativa puede utilizarse para distinguir entre diferentes cepas de un virus e incluso para detectar mutaciones puntuales. La principal ventaja de la PCR cuantitativa es que no requiere el análisis de los productos resultantes mediante electroforesis en gel. Esto significa que la PCR cuantitativa puede implementarse como una técnica de alto rendimiento para el cribado de muestras.

Se ha descrito la PCR cuantitativa para la detección [ 51 ] y discriminación de aislamientos de PVY O y PVY N [ 52 ] [ 53 ] y para la discriminación confiable entre aislamientos de PVY NTN y PVY N. [ 54 ]

Véase también

Notas y referencias

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  • Universidad de Stellenbosch - Departamento de Bioquímica