Análisis del valor phi

Análisis del valor Phi ,${\displaystyle \varphi }$análisis o${\displaystyle \varphi }$El análisis de valores es una técnica experimental de ingeniería de proteínas para estudiar las estructuras del estado de transición y los intermedios en el plegamiento de proteínas y los cambios conformacionales. ^{[ 1 ]} La estructura del estado de transición del plegamiento debe determinarse a partir de mediciones cinéticas y no es accesible mediante métodos de equilibrio como la RMN de proteínas o la cristalografía de rayos X ; además, los intermedios suelen ser móviles y parcialmente desestructurados por definición.${\displaystyle \varphi }$Mediante el análisis del valor φ, se comparan la cinética de plegamiento y la estabilidad conformacional del plegamiento de la proteína de tipo silvestre con las de mutantes puntuales para hallar los valores φ . Estos miden la contribución energética del residuo mutante al estado de transición del plegamiento, lo que revela el grado de estructura nativa alrededor del residuo mutado en el estado de transición, al tener en cuenta las energías libres relativas del estado desplegado, el estado plegado y el estado de transición para las proteínas de tipo silvestre y mutantes.

Los residuos de la proteína se mutan uno por uno para identificar grupos de residuos que estén bien ordenados en el estado de transición plegado. Las interacciones de estos residuos se pueden comprobar mediante un ciclo de doble mutación.${\displaystyle \varphi }$análisis , en el que se comparan los efectos de los mutantes de un solo sitio con los de los mutantes dobles. La mayoría de las mutaciones son conservadoras y reemplazan el residuo original por uno más pequeño ( mutaciones que crean cavidades ) como la alanina , aunque también se pueden usar mutantes de tirosina a fenilalanina , isoleucina a valina y treonina a serina . El inhibidor de quimotripsina , los dominios SH3 , el dominio WW , los dominios individuales de las proteínas L y G, la ubiquitina y la barnasa han sido estudiados por${\displaystyle \varphi }$análisis.

Phi se define así: ^{[ 2 ]}

$${\displaystyle \varphi ={\frac {(\Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{TS\rightarrow D})}{(\Delta G_{W}^{N\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{N\rightarrow D})}}={\frac {\Delta \Delta G^{TS\rightarrow D}}{\Delta \Delta G^{N\rightarrow D}}}}$$

${\displaystyle \Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}}$es la diferencia de energía entre el estado de transición y el estado desnaturalizado de la proteína de tipo salvaje ,${\displaystyle \Delta G_{M}^{TS\rightarrow D}}$es la misma diferencia de energía pero para la proteína mutante, y la${\displaystyle \Delta G^{N\rightarrow D}}$Los bits representan las diferencias de energía entre el estado nativo y el desnaturalizado. El valor phi se interpreta como la medida en que la mutación desestabiliza el estado de transición en comparación con el estado plegado.

Aunque${\displaystyle \varphi }$Puede que se pretendiera que abarcara de cero a uno, pueden aparecer valores negativos. ^{[ 3 ]} Un valor de cero sugiere que la mutación no afecta la estructura del estado de transición limitante de la velocidad de la vía de plegamiento, y un valor de uno sugiere que la mutación desestabiliza el estado de transición tanto como el estado plegado; los valores cercanos a cero sugieren que el área alrededor de la mutación está relativamente desplegada o desestructurada en el estado de transición, y los valores cercanos a uno sugieren que la estructura local del estado de transición cerca del sitio de mutación es similar a la del estado nativo. Las sustituciones conservadoras en la superficie de la proteína a menudo dan valores phi cercanos a uno. Cuando${\displaystyle \varphi }$Está bien entre cero y uno, es menos informativo ya que no nos dice cuál es el caso:

1. El estado de transición en sí mismo está parcialmente estructurado; o
2. Existen dos poblaciones de proteínas con un número casi igual de individuos: un tipo que se encuentra mayoritariamente desplegado y otro que se encuentra mayoritariamente plegado.

1. El análisis del valor phi se basa en el postulado de Hammond , que establece que la energía y la estructura química están correlacionadas. Si bien la relación entre las estructuras del intermedio de plegamiento y del estado nativo puede correlacionarse con la de sus energías cuando el paisaje energético presenta un mínimo global profundo y bien definido, las desestabilizaciones de la energía libre pueden no proporcionar información estructural útil cuando el paisaje energético es más plano o presenta muchos mínimos locales.
2. El análisis del valor phi presupone que la vía de plegamiento no se ve alterada significativamente, aunque las energías de plegamiento sí pueden verse afectadas. Dado que las mutaciones no conservativas podrían no confirmar esta suposición, se prefieren las sustituciones conservativas, aunque estas puedan generar desestabilizaciones energéticas menores y más difíciles de detectar.
3. Restringir${\displaystyle \varphi }$Atribuir valores mayores que cero a números es equivalente a suponer que la mutación no aumenta la estabilidad ni disminuye la energía del estado nativo ni del estado de transición. En la misma línea se asume que las interacciones que estabilizan un estado de transición de plegamiento son similares a las de la estructura nativa, aunque algunos estudios sobre el plegamiento de proteínas han demostrado que estabilizar interacciones no nativas en un estado de transición facilita el plegamiento. ^{[ 4 ]}

Alan Fersht fue pionero en el análisis del valor phi en su estudio de la pequeña proteína bacteriana barnasa . ^{[ 5 ] [ 6 ]} Utilizando simulaciones de dinámica molecular , descubrió que el estado de transición entre el plegamiento y el desplegamiento se parece al estado nativo y es el mismo independientemente de la dirección de la reacción. Phi varió con la ubicación de la mutación, ya que algunas regiones dieron valores cercanos a cero y otras cercanos a uno. La distribución de${\displaystyle \varphi }$Los valores a lo largo de la secuencia de la proteína coincidieron con todos los estados de transición simulados, excepto una hélice que se plegó de forma semiindependiente y estableció contactos similares a los nativos con el resto de la proteína solo una vez que el estado de transición se había formado por completo. Esta variación en la velocidad de plegamiento en una misma proteína dificulta su interpretación.${\displaystyle \varphi }$Los valores, como la estructura del estado de transición, deben compararse con simulaciones de plegamiento-desplegamiento, que son computacionalmente costosas.

Recientemente han aparecido otras técnicas de "perturbación cinética" para estudiar el estado de transición del plegamiento. La más conocida es la psi (${\displaystyle \psi }$) valor ^{[ 7 ] [ 8 ]} que se encuentra mediante la ingeniería de dos residuos de aminoácidos que se unen a metales, como la histidina, en una proteína y luego registrando la cinética de plegamiento en función de la concentración de iones metálicos, ^{[ 9 ]} aunque Fersht pensó que este enfoque era difícil. ^{[ 10 ]} Una variante de " entrecruzamiento " del${\displaystyle \varphi }$El valor - se utilizó para estudiar la asociación de segmentos en un estado de transición de plegamiento a medida que se introducían enlaces cruzados covalentes como los enlaces disulfuro . ^{[ 11 ]}${\displaystyle \varphi }$El análisis del valor -T se ha utilizado como una extensión de${\displaystyle \varphi }$Análisis del valor - para medir la respuesta de los mutantes en función de la temperatura para separar las contribuciones entálpicas y entrópicas a la energía libre del estado de transición. ^{[ 12 ]}

El error en las mediciones de estabilidad de equilibrio y velocidad de (des)plegamiento acuoso puede ser grande cuando los valores de${\displaystyle \varphi }$Las soluciones con desnaturalizantes deben extrapolarse a soluciones acuosas que sean casi puras o la diferencia de estabilidad entre la proteína nativa y la mutante sea "baja", o menos de 7 kJ/mol. Esto puede causar${\displaystyle \varphi }$caer más allá del rango cero-uno. ^{[ 13 ]} Valores calculados${\displaystyle \varphi }$depende en gran medida de la cantidad de puntos de datos disponibles. ^{[ 14 ]} Un diseño experimental cuidadoso minimiza los errores. ^{[ 15 ]} Un estudio de 78 mutantes del dominio WW con hasta cuatro mutaciones por residuo ha cuantificado qué tipos de mutaciones evitan la interferencia de la flexibilidad del estado nativo, la solvatación y otros efectos, y el análisis estadístico muestra que se puede obtener información confiable sobre la perturbación del estado de transición a partir de grandes cribados de mutantes. ^{[ 16 ]}

• Trama en forma de chevrón
• Punto medio de desnaturalización
• Despliegue del equilibrio