Trama de Chevron

Un gráfico de chevrones es una forma de representar los datos cinéticos del plegamiento de proteínas en presencia de concentraciones variables de desnaturalizante que altera la estructura terciaria nativa de la proteína . El gráfico se conoce como gráfico de "chevrones" debido a la v canónica , o forma de chevrones que se observa cuando el logaritmo de la tasa de relajación observada se representa como una función de la concentración de desnaturalizante.

En un sistema de dos estados, las tasas de plegamiento y desplegamiento dominan las tasas de relajación observadas por debajo y por encima del punto medio de desnaturalización (Cm). Esto da lugar a la terminología de brazos de plegamiento y desplegamiento para las extremidades del cheurón. Se puede obtener información a priori sobre el Cm de una proteína a partir de experimentos de equilibrio. Al ajustar a un modelo de dos estados, se supone que el logaritmo de las tasas de plegamiento y desplegamiento depende linealmente de la concentración de desnaturalizante, lo que da como resultado las pendientes m _f y m _u , llamadas valores m de plegamiento y desplegamiento, respectivamente (también llamados valores m cinéticos). La suma de las dos tasas es la tasa de relajación observada. Una concordancia entre el valor m de equilibrio y la suma absoluta de los valores m cinéticos se considera típicamente como una firma para el comportamiento de dos estados. La mayoría de los experimentos de desnaturalización informados se han llevado a cabo a 298 K con urea o cloruro de guanidinio (GuHCl) como desnaturalizantes.

Para generar la rama de plegado del cheurón, la proteína en una solución desnaturalizante altamente concentrada se diluye rápidamente (en menos de un milisegundo) en un tampón apropiado hasta una concentración particular de desnaturalizante por medio de un aparato de flujo detenido . La relajación hasta el nuevo equilibrio se controla mediante sondas espectroscópicas como la fluorescencia o, con menor frecuencia, mediante dicroísmo circular (CD). El volumen de la dilución se ajusta para obtener la tasa de relajación a una concentración específica de desnaturalizante. La concentración final de proteína en la mezcla suele ser de 1 a 20 μM, dependiendo de las restricciones impuestas por la amplitud de la relajación y la relación señal-ruido. La rama de desplegado se genera de manera similar mezclando proteína libre de desnaturalizante con una solución desnaturalizante concentrada en tampón. Cuando se grafica el logaritmo de estas tasas de relajación como una función de la concentración final de desnaturalizante, se obtiene un gráfico de cheurón.

La mezcla de las soluciones determina el tiempo muerto del instrumento, que es de aproximadamente un milisegundo. Por lo tanto, un aparato de flujo detenido solo se puede emplear para proteínas con un tiempo de relajación de unos pocos milisegundos. En los casos en que el tiempo de relajación es más corto que el tiempo muerto del instrumento, se reduce la temperatura experimental (aumentando así la viscosidad del agua/tampón) para aumentar el tiempo de relajación a unos pocos milisegundos. Por otro lado, para las proteínas de plegamiento rápido (es decir, aquellas con una tasa de relajación de 1 a 100 microsegundos), el salto de presión (tiempo muerto ~ algunos microsegundos), ^[1] el salto de temperatura (T-jump; tiempo muerto ~ algunos nanosegundos) o la mezcla de flujo continuo (tiempo muerto ~ algunos microsegundos), ^[2] se pueden llevar a cabo a diferentes concentraciones de desnaturalizante para obtener un gráfico de chevron.

Aunque se supone que las extremidades del chevron son lineales con la concentración de desnaturalizante, no siempre es así. Las no linealidades se observan generalmente en ambas extremidades o en una de ellas y se denominan "roll-overs" de chevron. La razón de tal observación no está clara. Se han propuesto muchas interpretaciones, incluidos los intermediarios en la vía, ^[3] limitaciones de tiempo muerto, movimientos de estados de transición ( efecto Hammond ), ^[4] artefactos de agregación, ^[5] plegamiento descendente , ^[6] y efectos Debye-Hückel inducidos por sal ^[7] para explicar este comportamiento. En muchos casos, los "roll-overs" de las extremidades de plegamiento se ignoran ya que ocurren a bajas concentraciones de desnaturalizante, y los datos se ajustan a un modelo de dos estados con una dependencia lineal de las tasas. Por lo tanto, las tasas de plegamiento informadas para tales proteínas en ausencia de desnaturalizantes son una sobreestimación.

• Plegamiento de proteínas
• Desnaturalización (bioquímica)
• Punto medio de desnaturalización
• Despliegue del equilibrio
• Análisis del valor phi