dímero de cebado

El software de diseño de cebadores utiliza algoritmos que verifican el potencial de formación de estructuras secundarias del ADN y el apareamiento de los cebadores consigo mismos o dentro de pares de cebadores. Los parámetros físicos que el software tiene en cuenta son la posible autocomplementariedad y el contenido de GC de los cebadores; temperaturas de fusión similares de los cebadores; y la ausencia de estructuras secundarias, como bucles de tallo , en la secuencia diana del ADN. ^{[ 2 ]}

Debido a que los cebadores están diseñados para tener una baja complementariedad entre sí, pueden hibridar (paso I en la figura) solo a baja temperatura, por ejemplo, a temperatura ambiente, como durante la preparación de la mezcla de reacción. Aunque las ADN polimerasas utilizadas en PCR son más activas alrededor de 70  °C, también tienen cierta actividad polimerizante a temperaturas más bajas, lo que puede causar síntesis de ADN a partir de los cebadores después de hibridar entre sí. ^{[ 3 ]} Se han desarrollado varios métodos para prevenir la formación de PD hasta que la reacción alcance la temperatura de trabajo de 60-70  °C, y estos incluyen la inhibición inicial de la ADN polimerasa o la separación física de los componentes de la reacción hasta que la mezcla de reacción alcance temperaturas más altas. Estos métodos se denominan PCR de inicio en caliente .

Cera : en este método, la enzima se separa espacialmente de la mezcla de reacción mediante cera, que se funde cuando la reacción alcanza una temperatura elevada. ^{[ 4 ]}

Liberación lenta de magnesio : la ADN polimerasa requiere iones de magnesio para su actividad, ^{[ 5 ]} por lo que el magnesio se separa químicamente de la reacción mediante la unión a un compuesto químico y se libera en la solución solo a alta temperatura ^{[ 6 ].}

Unión no covalente del inhibidor : en este método, un péptido , anticuerpo ^{[ 7 ]} o aptámero ^{[ 8 ]} se unen de forma no covalente a la enzima a baja temperatura e inhiben su actividad. Tras una incubación de 1 a 5 minutos a 95  °C, el inhibidor se libera y comienza la reacción.

Polimerasa Taq sensible al frío : es una ADN polimerasa modificada con actividad casi nula a bajas temperaturas. ^{[ 9 ]}

Modificación química : en este método, una molécula pequeña se une covalentemente a la cadena lateral de un aminoácido en el sitio activo de la ADN polimerasa. La molécula pequeña se libera de la enzima mediante la incubación de la mezcla de reacción durante 10-15 minutos a 95  °C. Una vez liberada la molécula pequeña, la enzima se activa. ^{[ 10 ]}

Otro método para prevenir o reducir la formación de PD consiste en modificar los cebadores de manera que la hibridación consigo mismos o entre sí no provoque extensión.

HANDS ( Homo -Tag Assisted Non - Dimer System ^{[ 11 ]} ): se añade una cola de nucleótidos, complementaria al extremo 3' del cebador, al extremo 5' del mismo. Debido a la proximidad de la cola 5', esta se une al extremo 3' del cebador. El resultado es un cebador con estructura de tallo-bucle que excluye la unión con solapamientos cortos, pero permite la unión del cebador a su secuencia totalmente complementaria en la secuencia diana.

Cebadores quiméricos : algunas bases de ADN en el cebador se reemplazan por bases de ARN, creando una secuencia quimérica . La temperatura de fusión de una secuencia quimérica con otra secuencia quimérica es menor que la de una secuencia quimérica con ADN. Esta diferencia permite ajustar la temperatura de hibridación de manera que el cebador se hibride con su secuencia diana, pero no con otros cebadores quiméricos. ^{[ 12 ]}

Cebadores bloqueables escindibles : un método conocido como PCR dependiente de RNasa H (rhPCR) ^{[ 13 ]} utiliza una RNasa HII termoestable para eliminar un grupo bloqueante de los cebadores de PCR a alta temperatura. Esta enzima RNasa HII prácticamente no presenta actividad a baja temperatura, por lo que la eliminación del bloqueo solo se produce a alta temperatura. La enzima también posee discriminación inherente entre desajustes de cebador y plantilla, lo que resulta en una selección adicional contra los dímeros de cebadores.

Sistemas de reconocimiento molecular autoevitantes : también conocidos como SAMRS, ^{[ 14 ]} eliminan los dímeros de cebadores mediante la introducción de análogos de nucleótidos T*, A*, G* y C* en el cebador. El ADN SAMRS puede unirse al ADN natural, pero no a otros miembros de la misma especie SAMRS. Por ejemplo, T* puede unirse a A pero no a A*, y A* puede unirse a T pero no a T*. Por lo tanto, mediante un diseño cuidadoso, ^{[ 15 ]} los cebadores construidos a partir de SAMRS pueden evitar las interacciones entre cebadores y permitir la detección sensible de SNP, así como la PCR múltiple.

Si bien los métodos anteriores están diseñados para reducir la formación de dímeros de pirimidina (DP), otro enfoque busca minimizar la señal generada por los DP en la PCR cuantitativa . Este enfoque es útil siempre que se formen pocos DP y su efecto inhibidor sobre la acumulación del producto sea mínimo.

PCR de cuatro pasos : se utiliza al trabajar con colorantes no específicos, como SYBR Green I. Se basa en la diferente longitud y, por lo tanto, en la diferente temperatura de fusión de los PD y la secuencia diana. En este método, la señal se adquiere por debajo de la temperatura de fusión de la secuencia diana, pero por encima de la temperatura de fusión de los PD. ^{[ 16 ]}

Sondas específicas de secuencia : Las sondas TaqMan y las sondas de baliza molecular generan señal solo en presencia de su secuencia objetivo (complementaria), y esta especificidad mejorada impide la adquisición de señal (pero no los posibles efectos inhibitorios sobre la acumulación del producto) de los PD.