PCR dependiente de RNasa H

La PCR dependiente de RNasa H (rhPCR) ^{[ 1 ]} es una modificación de la técnica de PCR estándar . En la rhPCR, los cebadores se diseñan con un bloque de amplificación removible en el extremo 3'. La amplificación del cebador bloqueado depende de la actividad de escisión de una enzima RNasa H de tipo II hipertermófila de arqueas durante la hibridación con la secuencia diana complementaria. Esta enzima RNasa H posee varias características útiles que mejoran la PCR. Primero, tiene muy poca actividad enzimática a baja temperatura, lo que permite una " PCR de inicio en caliente " sin modificaciones en la ADN polimerasa . Segundo, la eficiencia de escisión de la enzima se reduce en presencia de desajustes cerca del residuo de ARN. Esto permite una menor formación de dímeros de cebadores , ^{[ 1 ]} la detección de variantes de empalme alternativo , ^{[ 2 ] [ 3 ]} la capacidad de realizar PCR múltiple con un mayor número de cebadores de PCR y la capacidad de detectar polimorfismos de un solo nucleótido . ^{[ 4 ]}

Los cebadores de rhPCR constan de tres secciones: 1) La sección de ADN 5', equivalente en longitud y temperatura de fusión (Tm) a la de un cebador de PCR estándar, se extiende tras la escisión por la enzima RNasa HII. 2) Una única base de ARN proporciona el sitio de escisión para la RNasa HII. 3) Una corta extensión 3' de cuatro o cinco bases, seguida de un bloqueador (generalmente una molécula corta no extensible como el propanodiol ), impide la extensión por la ADN polimerasa hasta su eliminación. Una reacción de rhPCR comienza con los cebadores y la plantilla libres en solución (Figura 1). Mientras están libres en solución, estos cebadores no son desbloqueados por la enzima RNasa HII, ya que deben formar un heterodúplex ARN:ADN con la plantilla que se va a escindir. Una vez unidos a la plantilla, los cebadores de rhPCR son escindidos por la enzima termoestable RNasa HII. Esto elimina el bloqueo, permitiendo que la ADN polimerasa se extienda a partir de los cebadores. El ciclo de la reacción de PCR continúa el proceso. Los cebadores de rhPCR están diseñados de manera que, tras la escisión por la enzima RNasa H2, su Tm siga siendo superior a la temperatura de hibridación de la reacción de PCR. Estos cebadores pueden utilizarse tanto en la PCR cuantitativa con nucleasa 5' Taqman como en la PCR cuantitativa con SYBR Green .

La rhPCR se puede utilizar para PCR cuantitativa y en laboratorios médicos o medioambientales:

• ensayos de expresión génica
• Empalme alternativo
• Genotipado de SNP
• PCR múltiple

• PCR cuantitativa
• Taqman
• SYBR Verde
• reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
• Baliza molecular
• Expresión genética