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Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Gráfico de fluorescencia SYBR Green generado mediante PCR en tiempo real. Curva de fusión obtenida al final de la PCR en tiempo real. La reacción en cadena de la polimerasa en t...

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Gráfico de fluorescencia SYBR Green generado mediante PCR en tiempo real.
Curva de fusión obtenida al final de la PCR en tiempo real.

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real ( PCR en tiempo real o qPCR cuando se utiliza cuantitativamente) es una técnica de laboratorio de biología molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Monitoriza la amplificación de una molécula de ADN específica durante la PCR (es decir, en tiempo real), no al finalizarla, como en la PCR convencional. La PCR en tiempo real puede utilizarse de forma cuantitativa y semicuantitativa (es decir, por encima o por debajo de una cantidad determinada de moléculas de ADN).

Dos métodos comunes para la detección de productos de PCR en PCR en tiempo real son (1) colorantes fluorescentes no específicos que se intercalan con cualquier ADN de doble cadena y (2) sondas de ADN específicas de secuencia que consisten en oligonucleótidos que están marcados con un reportero fluorescente , lo que permite la detección solo después de la hibridación de la sonda con su secuencia complementaria.

Las directrices de Información Mínima para la Publicación de Experimentos de PCR Cuantitativa en Tiempo Real ( MIQE ), escritas por los profesores Stephen Bustin , Mikael Kubista , Michael Pfaffl y sus colegas, proponen que se utilice la abreviatura qPCR para la PCR cuantitativa en tiempo real y que se utilice RT-qPCR para la PCR cuantitativa con transcripción inversa. [ 1 ] El acrónimo "RT-PCR" suele referirse a la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa y no a la PCR en tiempo real.

Fondo

La PCR en tiempo real utiliza fluoróforos para detectar los niveles de expresión génica .

Las células de todos los organismos regulan la expresión génica mediante el recambio de transcritos génicos ( ARN monocatenario ): la cantidad de un gen expresado en una célula se puede medir por el número de copias de un transcrito de ARN de ese gen presente en una muestra. Para detectar y cuantificar de forma robusta la expresión génica a partir de pequeñas cantidades de ARN, es necesaria la amplificación del transcrito génico. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método común para amplificar el ADN; para la PCR basada en ARN, la muestra de ARN se transcribe primero inversamente a ADN complementario (ADNc) con transcriptasa inversa .

Para amplificar pequeñas cantidades de ADN, se utiliza la misma metodología que en la PCR convencional, empleando una plantilla de ADN, al menos un par de cebadores específicos , desoxirribonucleótidos trifosfato, una solución tampón adecuada y una ADN polimerasa termoestable . A esta mezcla se le añade una sustancia marcada con un fluoróforo en un termociclador que contiene sensores para medir la fluorescencia del fluoróforo tras su excitación a la longitud de onda requerida , lo que permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Esto permite medir la tasa de generación del producto amplificado en cada ciclo de PCR. Los datos generados pueden analizarse mediante software informático para calcular la expresión génica relativa (o el número de copias de ARNm ) en varias muestras. La PCR cuantitativa también puede aplicarse a la detección y cuantificación de ADN en muestras para determinar la presencia y abundancia de una secuencia de ADN específica en dichas muestras. [ 2 ] Esta medición se realiza después de cada ciclo de amplificación, y por ello este método se denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata o simultánea).

La PCR cuantitativa y los microarrays de ADN son metodologías modernas para estudiar la expresión génica . Se utilizaban métodos más antiguos para medir la abundancia de ARNm: visualización diferencial , ensayo de protección de ARNasa y Northern blot . El Northern blot se utiliza a menudo para estimar el nivel de expresión de un gen visualizando la abundancia de su transcrito de ARNm en una muestra. En este método, el ARN purificado se separa mediante electroforesis en gel de agarosa , se transfiere a una matriz sólida (como una membrana de nailon) y se hibrida con una sonda de ADN o ARN específica que es complementaria al gen de interés. Aunque esta técnica todavía se utiliza para evaluar la expresión génica, requiere cantidades relativamente grandes de ARN y proporciona solo información cualitativa o semicuantitativa de los niveles de ARNm. [ 3 ] Los errores de estimación que surgen de las variaciones en el método de cuantificación pueden ser el resultado de la integridad del ADN, la eficiencia enzimática y muchos otros factores. Por esta razón, se han desarrollado varios sistemas de estandarización (a menudo llamados métodos de normalización ). Algunos métodos se han desarrollado para cuantificar la expresión génica total, pero los más comunes se centran en cuantificar el gen específico que se estudia en relación con otro gen denominado gen normalizador, seleccionado por su nivel de expresión casi constante. Estos genes suelen seleccionarse entre los genes de mantenimiento celular, ya que sus funciones relacionadas con la supervivencia celular básica normalmente implican una expresión génica constitutiva . [ 4 ] [ 5 ] Esto permite a los investigadores informar una proporción de la expresión de los genes de interés dividida por la expresión del normalizador seleccionado, lo que permite comparar los primeros sin conocer realmente su nivel absoluto de expresión.

Los genes normalizadores más utilizados son los que codifican las siguientes moléculas: tubulina , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa , albúmina , ciclofilina y ARN ribosómicos . [ 3 ]

Principios básicos

La PCR en tiempo real se realiza en un termociclador con capacidad para iluminar cada muestra con un haz de luz de al menos una longitud de onda específica y detectar la fluorescencia emitida por el fluoróforo excitado . El termociclador también permite calentar y enfriar rápidamente las muestras, aprovechando así las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y la ADN polimerasa .

El proceso de PCR generalmente consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten 25–50 veces. Estos ciclos normalmente constan de tres etapas: la primera, a unos 95  °C, permite la separación de la doble cadena del ácido nucleico; la segunda, a una temperatura de unos 50–60  °C, permite la unión de los cebadores con la plantilla de ADN; [ 6 ] la tercera, entre 68 y 72  °C, facilita la polimerización llevada a cabo por la ADN polimerasa. Debido al pequeño tamaño de los fragmentos, el último paso se suele omitir en este tipo de PCR, ya que la enzima es capaz de replicar el amplicón de ADN durante el cambio entre la etapa de alineación y la etapa de desnaturalización. Además, en la PCR de cuatro pasos, la fluorescencia se mide durante fases de temperatura cortas que duran solo unos segundos en cada ciclo, con una temperatura de, por ejemplo, 80  °C, para reducir la señal causada por la presencia de dímeros de cebadores cuando se utiliza un colorante no específico. [ 7 ] Las temperaturas y los tiempos utilizados para cada ciclo dependen de una amplia variedad de parámetros, tales como: la enzima utilizada para sintetizar el ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) en la reacción y la temperatura de unión de los cebadores. [ 8 ]

Clasificación química

La técnica de PCR en tiempo real se puede clasificar según la química utilizada para detectar el producto de la PCR, ya sean fluorocromos específicos o no específicos.

Detección no específica: PCR en tiempo real con colorantes de unión a ADN de doble cadena como marcadores.

Un colorante que se une al ADN se adhiere a todo el ADN de doble cadena (dsDNA) durante la PCR, aumentando el rendimiento cuántico de fluorescencia del colorante. Por lo tanto, un aumento en la cantidad de producto de ADN durante la PCR conlleva un aumento en la intensidad de fluorescencia medida en cada ciclo. Sin embargo, los colorantes para dsDNA, como SYBR Green, se unen a todos los productos de PCR de dsDNA, incluidos los productos de PCR inespecíficos (como los dímeros de cebadores ). Esto puede interferir o impedir la monitorización precisa de la secuencia diana prevista.

En la PCR en tiempo real con colorantes para ADN bicatenario, la reacción se prepara como de costumbre, añadiendo un colorante fluorescente para ADN bicatenario. A continuación, la reacción se lleva a cabo en un termociclador y, tras cada ciclo, se mide la intensidad de la fluorescencia con un detector; el colorante solo emite fluorescencia cuando se une al ADN bicatenario (es decir, al producto de la PCR). Este método tiene la ventaja de requerir únicamente un par de cebadores para la amplificación, lo que reduce los costes; además, se pueden monitorizar múltiples secuencias diana en un mismo tubo utilizando diferentes tipos de colorantes.

Detección específica: método de sonda reportera fluorescente

(1) En sondas intactas, la fluorescencia del reportero se extingue. (2) Las sondas y la cadena de ADN complementaria se hibridan y la fluorescencia del reportero permanece extinguida. (3) Durante la PCR, la sonda se degrada por la polimerasa Taq y se libera el reportero fluorescente.

Las sondas fluorescentes reporteras detectan únicamente el ADN que contiene la secuencia complementaria a la sonda; por lo tanto, su uso aumenta significativamente la especificidad y permite realizar la técnica incluso en presencia de otro ADN bicatenario. Mediante el uso de marcadores de diferentes colores, las sondas fluorescentes pueden emplearse en ensayos multiplex para monitorizar varias secuencias diana en el mismo tubo. La especificidad de las sondas fluorescentes reporteras también evita la interferencia en las mediciones causada por los dímeros de cebadores , que son subproductos potenciales indeseables en la PCR. Sin embargo, las sondas fluorescentes reporteras no impiden el efecto inhibidor de los dímeros de cebadores, que puede disminuir la acumulación de los productos deseados en la reacción.

El método se basa en una sonda de ADN con un marcador fluorescente en un extremo y un supresor de fluorescencia en el extremo opuesto. La proximidad entre el marcador y el supresor impide la detección de su fluorescencia; la degradación de la sonda por la actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq rompe esta proximidad, permitiendo así la emisión de fluorescencia sin suprimir, la cual puede detectarse tras la excitación con un láser. Por lo tanto, un aumento en el producto al que se dirige la sonda en cada ciclo de PCR provoca un aumento proporcional de la fluorescencia debido a la degradación de la sonda y la liberación del marcador.

  1. La PCR se prepara como de costumbre (véase PCR ) y se añade la sonda reportera.
  2. Al comenzar la reacción, durante la etapa de hibridación de la PCR, tanto la sonda como los cebadores se unen al ADN objetivo.
  3. La polimerización de una nueva cadena de ADN se inicia a partir de los cebadores, y una vez que la polimerasa alcanza la sonda, su exonucleasa 5'-3' degrada la sonda, separando físicamente el reportero fluorescente del extintor, lo que resulta en un aumento de la fluorescencia.
  4. La fluorescencia se detecta y se mide en una máquina de PCR en tiempo real, y su aumento geométrico, que corresponde al aumento exponencial del producto, se utiliza para determinar el ciclo de cuantificación (C q ) en cada reacción.

Análisis de la temperatura de fusión

Curvas de fusión distintas para varios productos de PCR (que muestran colores distintos). Se pueden observar reacciones de amplificación para un producto específico (rosa, azul) y otros con resultado negativo (verde, naranja). El pico de fusión indicado con una flecha muestra el pico causado por dímeros de cebadores, que es diferente del producto de amplificación esperado. [ 9 ]

La PCR en tiempo real permite la identificación de fragmentos de ADN amplificados específicos mediante el análisis de su temperatura de fusión (también llamada valor Tm , por sus siglas en inglés ). El método empleado suele ser la PCR con colorantes que se unen al ADN de doble cadena como marcadores, y el colorante utilizado habitualmente es SYBR Green. La temperatura de fusión del ADN es específica del fragmento amplificado. Los resultados de esta técnica se obtienen comparando las curvas de disociación de las muestras de ADN analizadas. [ 10 ]

A diferencia de la PCR convencional, este método evita el uso previo de técnicas de electroforesis para demostrar los resultados de todas las muestras. Esto se debe a que, a pesar de ser una técnica cinética, la PCR cuantitativa se evalúa generalmente en un punto final definido. Por lo tanto, la técnica suele proporcionar resultados más rápidos y/o utiliza menos reactivos que la electroforesis. Si se requiere una electroforesis posterior, solo es necesario analizar aquellas muestras que la PCR en tiempo real haya mostrado resultados dudosos y/o para ratificar los resultados de las muestras que hayan dado positivo para un determinante específico.

Modelado

A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite monitorizar el producto deseado en cualquier punto del proceso de amplificación midiendo la fluorescencia (en tiempo real, se mide su nivel por encima de un umbral determinado). Un método comúnmente empleado de cuantificación de ADN mediante PCR en tiempo real se basa en representar gráficamente la fluorescencia frente al número de ciclos en una escala logarítmica . Se establece un umbral para la detección de la fluorescencia basada en ADN de 3 a 5 veces la desviación estándar del ruido de la señal por encima del fondo. El número de ciclos en los que la fluorescencia supera el umbral se denomina ciclo umbral (C t ) o, según las directrices MIQE, ciclo de cuantificación (C q ) . [ 1 ] Utilizando este método, cuanto mayor sea la cantidad de ARNm inicial, menor será el C q.

Durante la fase de amplificación exponencial, la cantidad de la plantilla de ADN objetivo (amplicón) se duplica en cada ciclo. Por ejemplo, una muestra de ADN cuyo C q precede al de otra muestra en 3 ciclos contenía 2 3 = 8 veces más plantilla. Sin embargo, la eficiencia de la amplificación suele ser variable entre cebadores y plantillas. Por lo tanto, la eficiencia de una combinación de cebador-plantilla se evalúa en un experimento de titulación con diluciones seriadas de la plantilla de ADN para crear una curva estándar del cambio en (C q ) con cada dilución. La pendiente de la regresión lineal se utiliza para determinar la eficiencia de la amplificación, que es del 100 % si una dilución de 1:2 resulta en una diferencia de (C q ) de 1. El método del umbral de ciclo hace varias suposiciones sobre el mecanismo de reacción y depende de datos de regiones de baja relación señal/ruido del perfil de amplificación, lo que puede introducir una varianza sustancial durante el análisis de datos. [ 11 ]

Para cuantificar la expresión génica, se resta el (C q ) de un ARN o ADN del gen de interés del (C q ) de un ARN/ADN de un gen de referencia en la misma muestra para normalizar la variación en la cantidad y calidad del ARN entre diferentes muestras. Este procedimiento de normalización se conoce comúnmente como el método ΔC t [ 12 ] y permite comparar la expresión de un gen de interés entre diferentes muestras. Sin embargo, para dicha comparación, la expresión del gen de referencia normalizador debe ser muy similar en todas las muestras. Por lo tanto, elegir un gen de referencia que cumpla este criterio es de gran importancia y, a menudo, un desafío, ya que muy pocos genes muestran niveles de expresión iguales en una variedad de condiciones o tejidos diferentes. [ 13 ] [ 14 ] Aunque el análisis del umbral de ciclo está integrado en muchos sistemas de software comerciales, existen métodos más precisos y fiables para analizar los datos del perfil de amplificación que deben considerarse en los casos en que la reproducibilidad sea una preocupación. [ 11 ]

También se han propuesto métodos de cuantificación de qPCR basados ​​en el mecanismo, los cuales tienen la ventaja de no requerir una curva estándar para la cuantificación. Se ha demostrado que métodos como MAK2 [ 15 ] tienen un rendimiento cuantitativo igual o superior al de los métodos con curva estándar. Estos métodos basados ​​en el mecanismo utilizan el conocimiento del proceso de amplificación de la polimerasa para generar estimaciones de la concentración original de la muestra. Una extensión de este enfoque incluye un modelo preciso del perfil completo de la reacción de PCR, lo que permite el uso de datos con una alta relación señal-ruido y la capacidad de validar la calidad de los datos antes del análisis. [ 11 ]

Según la investigación de Ruijter et al. [ 16 ] , MAK2 asume una eficiencia de amplificación constante durante la reacción de PCR. Sin embargo, el análisis teórico de la reacción en cadena de la polimerasa, de la cual se derivó MAK2, ha revelado que la eficiencia de amplificación no es constante a lo largo de la PCR. Si bien la cuantificación con MAK2 proporciona estimaciones fiables de la concentración de ADN diana en una muestra bajo condiciones normales de qPCR, MAK2 no cuantifica de forma fiable la concentración diana en ensayos de qPCR con competímetros.

Aplicaciones

La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa tiene numerosas aplicaciones en el laboratorio . Se utiliza comúnmente tanto para diagnóstico como para investigación básica . En la industria, esta técnica se emplea para cuantificar la carga microbiana en alimentos o materia vegetal, detectar organismos genéticamente modificados (OGM ) y cuantificar y genotipificar patógenos virales humanos.

Cuantificación de la expresión génica

La cuantificación de la expresión génica mediante métodos tradicionales de detección de ADN no es fiable. La detección de ARNm en un Northern blot o de productos de PCR en un gel o Southern blot no permite una cuantificación precisa. [ 17 ] Por ejemplo, durante los 20-40 ciclos de una PCR típica, la cantidad de producto de ADN alcanza una meseta que no se correlaciona directamente con la cantidad de ADN diana en la PCR inicial. [ 18 ]

La PCR en tiempo real puede utilizarse para cuantificar ácidos nucleicos mediante dos métodos comunes: cuantificación relativa y cuantificación absoluta. [ 19 ] La cuantificación absoluta proporciona el número exacto de moléculas de ADN diana mediante comparación con estándares de ADN utilizando una curva de calibración . Por lo tanto, es esencial que la PCR de la muestra y el estándar tengan la misma eficiencia de amplificación . [ 20 ] La cuantificación relativa se basa en genes de referencia internos para determinar las diferencias de expresión del gen diana. La cuantificación se expresa como el cambio en los niveles de expresión del ARNm interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por transcripción inversa del ARNm). La cuantificación relativa es más fácil de llevar a cabo ya que no requiere una curva de calibración, puesto que la cantidad del gen estudiado se compara con la cantidad de un gen de referencia de control.

Dado que las unidades utilizadas para expresar los resultados de la cuantificación relativa no son importantes, los resultados pueden compararse entre diferentes RT-qPCR. El motivo para utilizar uno o más genes de referencia es corregir la variación no específica, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN utilizado, que pueden afectar la eficiencia de la transcripción inversa y, por lo tanto, la de todo el proceso de PCR. Sin embargo, el aspecto más crucial del proceso es que el gen de referencia debe ser estable. [ 21 ]

La selección de estos genes de referencia se realizaba tradicionalmente en biología molecular mediante estudios cualitativos o semicuantitativos, como el examen visual de geles de ARN, la densitometría Northern blot o la PCR semicuantitativa (PCR mimics). Ahora, en la era del genoma , es posible realizar una estimación más detallada para muchos organismos utilizando tecnologías transcriptómicas . [ 22 ] Sin embargo, la investigación ha demostrado que la amplificación de la mayoría de los genes de referencia utilizados para cuantificar la expresión de ARNm varía según las condiciones experimentales. [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] Por lo tanto, es necesario realizar un estudio metodológico inicial estadísticamente sólido para seleccionar el gen de referencia más adecuado.

Se han desarrollado varios algoritmos estadísticos que pueden detectar qué gen o genes son más adecuados para su uso en determinadas condiciones. Algunos, como geNORM o BestKeeper, pueden comparar pares o medias geométricas para una matriz de diferentes genes y tejidos de referencia . [ 3 ] [ 5 ] El flujo de trabajo completo del análisis de qPCR con propagación de errores adecuada está implementado en GenEx.

Usos diagnósticos

La PCR cualitativa diagnóstica se aplica para detectar rápidamente ácidos nucleicos que son diagnósticos de, por ejemplo, enfermedades infecciosas , [ 26 ] [ 27 ] cáncer y anomalías genéticas. La introducción de ensayos de PCR cualitativa en el laboratorio de microbiología clínica ha mejorado significativamente el diagnóstico de enfermedades infecciosas, [ 28 ] y se utiliza como herramienta para detectar enfermedades emergentes, como nuevas cepas de gripe y coronavirus , [ 29 ] en pruebas diagnósticas . [ 30 ] [ 31 ]

Usos microbiológicos

La PCR cuantitativa también es utilizada por microbiólogos que trabajan en los campos de la seguridad alimentaria, el deterioro y la fermentación de los alimentos, así como para la evaluación del riesgo microbiano de la calidad del agua (aguas potables y recreativas) y en la protección de la salud pública. [ 32 ]

La qPCR también puede utilizarse para amplificar marcadores taxonómicos o funcionales de genes en ADN tomado de muestras ambientales. [ 33 ] Los marcadores están representados por fragmentos genéticos de ADN o ADN complementario. [ 33 ] Al amplificar un determinado elemento genético, se puede cuantificar la cantidad de dicho elemento en la muestra antes de la amplificación. [ 33 ] El uso de marcadores taxonómicos (genes ribosomales) y qPCR puede ayudar a determinar la cantidad de microorganismos en una muestra y puede identificar diferentes familias, géneros o especies según la especificidad del marcador. [ 33 ] El uso de marcadores funcionales (genes codificadores de proteínas) puede mostrar la expresión génica dentro de una comunidad, lo que puede revelar información sobre el medio ambiente. [ 33 ]

Detección de fitopatógenos

La industria agrícola se esfuerza constantemente por producir propágulos o plántulas libres de patógenos para prevenir pérdidas económicas y salvaguardar la salud. Se han desarrollado sistemas que permiten detectar pequeñas cantidades de ADN de Phytophthora ramorum , un oomiceto que mata robles y otras especies, mezclado con el ADN de la planta huésped. La discriminación entre el ADN del patógeno y el de la planta se basa en la amplificación de secuencias ITS, espaciadores ubicados en la región codificante del gen del ARN ribosómico , que son característicos de cada taxón. [ 34 ] También se han desarrollado versiones de campo de esta técnica para identificar el mismo patógeno. [ 35 ]

Detección de organismos genéticamente modificados

La qPCR con transcripción inversa (RT-qPCR) puede utilizarse para detectar OGM debido a su sensibilidad y rango dinámico en la detección de ADN. Las alternativas, como el análisis de ADN o proteínas, suelen ser menos sensibles. Se utilizan cebadores específicos que amplifican no el transgén, sino el promotor , el terminador o incluso secuencias intermedias utilizadas durante el proceso de ingeniería del vector. Dado que el proceso de creación de una planta transgénica normalmente conlleva la inserción de más de una copia del transgén, también se suele evaluar su cantidad. Esto se realiza a menudo mediante cuantificación relativa utilizando un gen de control de la especie tratada que solo está presente como una única copia. [ 36 ] [ 37 ]

Cuantificación clínica y genotipado

Los virus pueden estar presentes en humanos debido a infección directa o coinfecciones, lo que dificulta el diagnóstico utilizando técnicas clásicas y puede resultar en un pronóstico y tratamiento incorrectos. El uso de qPCR permite tanto la cuantificación como la genotipificación (caracterización de la cepa, realizada utilizando curvas de fusión) de un virus como el virus de la hepatitis B. [ 38 ] El grado de infección, cuantificado como copias del genoma viral por unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos; por ejemplo, la probabilidad de que el virus del herpes simple tipo 1 se reactive está relacionada con el número de neuronas infectadas en los ganglios . [ 39 ] Esta cuantificación se lleva a cabo con transcripción inversa o sin ella, como ocurre si el virus se integra en el genoma humano en cualquier punto de su ciclo, como sucede en el caso del VPH (virus del papiloma humano), donde algunas de sus variantes están asociadas con la aparición de cáncer de cuello uterino . [ 40 ] La PCR en tiempo real también ha permitido la cuantificación del citomegalovirus humano (CMV), que se observa en pacientes inmunodeprimidos tras un trasplante de órgano sólido o de médula ósea. [ 41 ]

Referencias

  1. 1 2 Bustin, Stephen A; Benes, Vladimir; Garson, Jeremy A; Hellemans, Jan; Huggett, Jim; Kubista, Mikael; Mueller, Reinhold; Nolan, Tania; Pfaffl, Michael W; Shipley, Gregory L; Vandesompele, Jo; Wittwer, Carl T (1 de abril de 2009). "Las directrices MIQE: información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real" . Química Clínica . 55 (4): 611– 622. doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID 19246619 . 
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