Ensamblaje de secuencias

En bioinformática , el ensamblaje de secuencias se refiere a la alineación y fusión de fragmentos de una secuencia de ADN más larga para reconstruir la secuencia original. ^{[ 1 ]} Esto es necesario ya que la tecnología de secuenciación de ADN podría no ser capaz de "leer" genomas completos de una sola vez, sino que lee pequeños fragmentos de entre 20 y 30 000 bases, dependiendo de la tecnología utilizada. ^{[ 1 ]} Por lo general, los fragmentos cortos (lecturas) resultan de la secuenciación aleatoria de ADN genómico o de transcripciones genéticas ( EST ). ^{[ 1 ]}

El problema de reconstruir una secuencia de textos se puede comparar con tomar muchas copias de un libro, triturarlas con cuchillas diferentes y reconstruir el texto observando los fragmentos. Además de la evidente dificultad de esta tarea, existen otros problemas prácticos: el original puede contener muchos párrafos repetidos, y algunos fragmentos pueden modificarse durante la trituración, introduciendo errores tipográficos. También pueden añadirse extractos de otro libro, y algunos fragmentos pueden resultar completamente irreconocibles.

Existen tres enfoques para recopilar datos de secuenciación:

1. De novo: ensamblaje de lecturas de secuenciación para crear secuencias de longitud completa (a veces novedosas), sin utilizar una plantilla (véase ensambladores de secuencias de novo , ensamblaje de transcriptoma de novo ) ^{[ 2 ]}
2. Mapeo/Alineación: ensamblaje de lecturas mediante su alineación con una plantilla (también conocida como referencia). El consenso ensamblado puede no ser idéntico a la plantilla.
3. Ensamblaje guiado por referencia: agrupación de lecturas por similitud con la región más similar dentro de la referencia (mapeo por pasos). Las lecturas dentro de cada grupo se acortan para imitar la calidad de lecturas cortas. Un método típico para hacerlo es el enfoque de k-meros . El ensamblaje guiado por referencia es más útil con lecturas largas . ^{[ 3 ]}

El ensamblaje guiado por referencia combina las características de otros métodos. Este método se aplica a lecturas largas para imitar las ventajas de las lecturas cortas (por ejemplo, la calidad de la llamada). Su lógica consiste en agrupar las lecturas en ventanas más pequeñas dentro de la secuencia de referencia. A continuación, se reduce el tamaño de las lecturas de cada grupo mediante el método k-mer para seleccionar la secuencia contigua (contig) de mayor calidad y probabilidad. Posteriormente, los contigs se unen para crear un andamio. El consenso final se obtiene cerrando cualquier hueco en el andamio.

La complejidad del ensamblaje de secuencias viene determinada por dos factores principales: el número de fragmentos y su longitud. Si bien un mayor número de fragmentos y su longitud permiten una mejor identificación de las superposiciones de secuencias, también plantean problemas, ya que los algoritmos subyacentes muestran una complejidad cuadrática o incluso exponencial con respecto al número y la longitud de los fragmentos. Por otro lado, si bien las secuencias más cortas se alinean más rápidamente, también complican la fase de diseño del ensamblaje, puesto que las lecturas más cortas son más difíciles de utilizar con repeticiones o repeticiones casi idénticas.

En los inicios de la secuenciación del ADN, los científicos solo podían obtener unas pocas secuencias cortas (de unas pocas docenas de bases) tras semanas de trabajo en los laboratorios. Por lo tanto, estas secuencias podían alinearse manualmente en cuestión de minutos.

En 1975, se inventó el método de terminación dideoxi (también conocido como secuenciación de Sanger ) y hasta poco después del año 2000, la tecnología se mejoró hasta un punto en el que las máquinas totalmente automatizadas podían generar secuencias en un modo altamente paralelizado las 24 horas del día. Grandes centros de genómica de todo el mundo albergaban granjas completas de estas máquinas de secuenciación, lo que a su vez llevó a la necesidad de que los ensambladores se optimizaran para secuencias de proyectos de secuenciación de escopeta de genoma completo donde las lecturas

• tienen aproximadamente entre 800 y 900 bases de longitud.
• contienen artefactos de secuenciación como vectores de secuenciación y clonación
• tienen tasas de error entre 0,5 y 10%

Con la tecnología Sanger, los proyectos bacterianos con entre 20 000 y 200 000 lecturas podían ensamblarse fácilmente en un solo ordenador. Los proyectos de mayor envergadura, como el genoma humano con aproximadamente 35 millones de lecturas, requerían grandes centros de computación y computación distribuida.

Para 2004/2005, la pirosecuenciación había alcanzado la viabilidad comercial gracias a 454 Life Sciences . ^{[ 9 ]} Este nuevo método de secuenciación generaba lecturas mucho más cortas que las de la secuenciación de Sanger: inicialmente de unas 100 bases, ahora de 400 a 500 bases. ^{[ 9 ]} Su rendimiento mucho mayor y su menor coste (en comparación con la secuenciación de Sanger) impulsaron la adopción de esta tecnología por parte de los centros genómicos, lo que a su vez impulsó el desarrollo de ensambladores de secuencias que pudieran manejar eficientemente los conjuntos de lecturas. La enorme cantidad de datos, junto con los patrones de error específicos de la tecnología en las lecturas, retrasó el desarrollo de los ensambladores; a principios de 2004, solo estaba disponible el ensamblador Newbler de 454. Publicada a mediados de 2007, la versión híbrida del ensamblador MIRA por Chevreux et al. ^{[ 10 ]} fue el primer ensamblador disponible gratuitamente que podía ensamblar lecturas de 454, así como mezclas de lecturas de 454 y lecturas de Sanger. El ensamblaje de secuencias de diferentes tecnologías de secuenciación se denominó posteriormente ensamblaje híbrido . ^{[ 10 ]}

Desde 2006, la tecnología Illumina (anteriormente Solexa) está disponible y puede generar alrededor de 100 millones de lecturas por ejecución en una sola máquina de secuenciación. Compárese esto con los 35 millones de lecturas del proyecto del genoma humano que necesitaron varios años para producirse en cientos de máquinas de secuenciación. ^{[ 11 ]} Illumina inicialmente estaba limitado a una longitud de solo 36 bases, lo que lo hacía menos adecuado para el ensamblaje de novo (como el ensamblaje de novo del transcriptoma ), pero las iteraciones más recientes de la tecnología lograron longitudes de lectura superiores a 100 bases desde ambos extremos de un clon de 3–400 bp. ^{[ 11 ]} Anunciado a finales de 2007, el ensamblador SHARCGS ^{[ 12 ]} por Dohm et al. fue el primer ensamblador publicado que se utilizó para un ensamblaje con lecturas Solexa. Rápidamente le siguieron varios otros.

Posteriormente, se lanzaron nuevas tecnologías como SOLiD de Applied Biosystems , Ion Torrent y SMRT , y continuaron surgiendo otras nuevas (por ejemplo, la secuenciación de nanoporos ). A pesar de las mayores tasas de error de estas tecnologías, son importantes para el ensamblaje porque su mayor longitud de lectura ayuda a abordar el problema de las repeticiones. ^{[ 11 ]} Es imposible ensamblar a través de una repetición perfecta que sea más larga que la longitud máxima de lectura; sin embargo, a medida que las lecturas se hacen más largas, la probabilidad de una repetición perfecta de ese tamaño disminuye. Esto otorga a las lecturas de secuenciación más largas una ventaja en el ensamblaje de repeticiones, incluso si tienen una precisión baja (≈85%). ^{[ 11 ]}

La mayoría de los ensambladores de secuencias tienen algoritmos incorporados para el control de calidad, como Phred . ^{[ 13 ]} Sin embargo, tales medidas no evalúan la completitud del ensamblaje en términos de contenido genético. Algunas herramientas evalúan la calidad de un ensamblaje a posteriori.

Por ejemplo, BUSCO (Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs) es una medida de la completitud de los genes en un genoma, conjunto de genes o transcriptoma , utilizando el hecho de que muchos genes están presentes solo como genes de copia única en la mayoría de los genomas. ^{[ 14 ]} Los conjuntos BUSCO iniciales representaban 3023 genes para vertebrados , 2675 para artrópodos , 843 para metazoos , 1438 para hongos y 429 para eucariotas . Esta tabla muestra un ejemplo para los genomas humano y de la mosca de la fruta: ^{[ 14 ]}

Los distintos organismos poseen una región específica de mayor complejidad dentro de su genoma. Por lo tanto, se requieren diferentes enfoques computacionales. Algunos de los algoritmos más utilizados son:

Ensamblaje de gráficos

Se basa en la teoría de grafos de la informática. El grafo de De Bruijn es un ejemplo de este enfoque y utiliza k-meros para ensamblar una secuencia contigua (contig) a partir de lecturas. ^{[ 15 ]}

Ensamblaje de grafos voraz

Este método evalúa cada lectura añadida al ensamblaje y selecciona la puntuación más alta posible de la región superpuesta.

Dado un conjunto de fragmentos de secuencia, el objetivo es encontrar una secuencia más larga que contenga todos los fragmentos (véase la figura en Tipos de ensamblaje de secuencias ):

1. Calcular alineamientos por pares de todos los fragmentos.
2. Elige dos fragmentos con la mayor superposición.
3. Combinar los fragmentos seleccionados.
4. Repita los pasos 2 y 3 hasta que solo quede un fragmento.

El resultado podría no ser la solución óptima al problema.

En general, existen tres pasos para ensamblar las lecturas de secuenciación en un andamio:

1. Preensamblaje: Este paso es esencial para garantizar la integridad del análisis posterior, como la detección de variantes o la secuencia final del andamiaje. Este paso consta de dos flujos de trabajo cronológicos:
   1. Control de calidad: Dependiendo del tipo de tecnología de secuenciación, pueden surgir diferentes errores que lleven a una llamada de base errónea . Por ejemplo, la secuenciación de "NAAAAAAAAAAAAN" y "NAAAAAAAAAAAN", que incluyen 12 adeninas, podría interpretarse erróneamente como 11 adeninas. La secuenciación de un segmento altamente repetitivo del ADN/ARN objetivo podría resultar en una llamada con una base menos o una base más. La calidad de lectura se mide normalmente mediante puntuaciones de calidad Phred , que son una puntuación codificada de la calidad de cada nucleótido dentro de la secuencia de lectura.
   2. Filtrado de lecturas: Las lecturas que no superaron la verificación de calidad deben eliminarse del archivo FASTQ para obtener los mejores contigs de ensamblaje.
2. Ensamblaje: Durante este paso, se utiliza la alineación de lecturas con diferentes criterios para mapear cada lectura a la ubicación posible. La posición predicha de una lectura se basa en cuánto de su secuencia se alinea con otras lecturas o con una referencia. Se utilizan diferentes algoritmos de alineación para lecturas de diferentes tecnologías de secuenciación. Algunos de los enfoques comúnmente utilizados en el ensamblaje son el grafo de De Bruijn y la superposición. La longitud de lectura, la cobertura , la calidad y la técnica de secuenciación utilizada juegan un papel importante en la elección del mejor algoritmo de alineación en el caso de la secuenciación de próxima generación . ^{[ 16 ]} Por otro lado, los algoritmos que alinean lecturas de secuenciación de tercera generación requieren enfoques avanzados para tener en cuenta la alta tasa de error asociada con ellas.
3. Postensamblaje: Esta etapa se centra en extraer información valiosa de la secuencia ensamblada. La genómica comparativa y el análisis de poblaciones son ejemplos de análisis postensamblaje.

Para obtener una lista de ensambladores de novo , consulte Ensambladores de secuencias de novo . Para obtener una lista de alineadores de mapeo, consulte Lista de software de alineación de secuencias § Alineación de secuencias de lectura corta .

Algunas de las herramientas comunes utilizadas en las diferentes etapas del ensamblaje se enumeran en la siguiente tabla:

• Ensambladores de secuencias de novo
• Alineación de secuencias
• Montaje del transcriptoma de novo
• Problema de la cubierta del conjunto
• Lista de genomas animales secuenciados
• Ensamblaje del genoma vegetal