Southern blot

La transferencia Southern es un método utilizado para la detección y cuantificación de una secuencia de ADN específica en muestras de ADN. Este método se utiliza en biología molecular . En resumen, el ADN purificado de una muestra biológica (como sangre o tejido) se digiere con enzimas de restricción , y los fragmentos de ADN resultantes se separan mediante electroforesis utilizando una corriente eléctrica para moverlos a través de un gel o matriz porosa, lo que permite que los fragmentos más pequeños se muevan más rápido que los más grandes. Los fragmentos de ADN se transfieren del gel o matriz a una membrana sólida, que luego se expone a una sonda de ADN marcada con una etiqueta radiactiva, fluorescente o química. La etiqueta permite visualizar en la transferencia Southern cualquier fragmento de ADN que contenga secuencias complementarias a la secuencia de la sonda de ADN. ^{[ 1 ]}

La transferencia Southern combina la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis a una membrana de filtro en un proceso llamado transferencia , y la posterior detección de fragmentos mediante hibridación con sonda . ^{[ 2 ]}

El método recibe su nombre del biólogo británico Edwin Southern , quien lo publicó por primera vez en 1975. ^{[ 3 ]} Otros métodos de transferencia (es decir, transferencia Western , ^{[ 4 ]} transferencia Northern , transferencia Eastern , transferencia Southwestern ) que emplean principios similares, pero utilizando ARN o proteínas, han sido nombrados posteriormente con nombres de puntos cardinales como una especie de juego de palabras con el nombre de Southern. Como la etiqueta es epónima , Southern se escribe con mayúscula, como es convencional para los nombres propios . Los nombres de otros métodos de transferencia pueden seguir esta convención, por analogía. ^{[ 5 ]}

Southern inventó la técnica Southern blot tras combinar tres innovaciones. La primera son las endonucleasas de restricción, desarrolladas en la Universidad Johns Hopkins por Tom Kelly y Hamilton Smith . Estas endonucleasas se utilizan para cortar el ADN en una secuencia específica. Kenneth y Noreen Murray introdujeron esta técnica como Southern. La segunda innovación es la electroforesis en gel, que se basa en la separación de mezclas de ADN, ARN o proteínas según su tamaño molecular, también desarrollada en la Universidad Johns Hopkins por Daniel Nathans y Kathleen Danna en 1971. La tercera innovación es el método de transferencia por transferencia, desarrollado por Frederick Sanger , quien transfirió moléculas de ARN a papel DEAE. La técnica Southern blot se inventó en 1973, pero no se publicó hasta 1975. Aunque se publicó más tarde, la técnica se difundió cuando Southern la presentó a un científico del Laboratorio Cold Spring Harbor llamado Michael Mathews, dibujándola en un papel. ^{[ 6 ]}

El ADN genómico se digiere con una o más enzimas de restricción, y luego los fragmentos de ADN se fraccionan por tamaño mediante electroforesis en gel. Antes de transferir los fragmentos de ADN a una membrana sólida, ya sea de nailon o nitrocelulosa, se desnaturalizan mediante tratamiento alcalino. ^{[ 7 ]} Una vez inmovilizados los fragmentos de ADN en la membrana, se utilizan métodos de prehibridación para reducir la unión inespecífica de la sonda. A continuación, los fragmentos en la membrana se hibridan con sondas de ADN, ARN u oligonucleótidos, marcadas con o sin marcaje radiactivo, que son complementarias a la secuencia de ADN diana. Finalmente, se utilizan métodos de detección para visualizar el ADN diana. ^{[ 8 ]}

1. Aislamiento de ADN: El ADN que se va a estudiar se aísla de diversos tejidos. La fuente más adecuada de ADN es la sangre. Sin embargo, también se puede aislar de otros tejidos (cabello, semen, saliva, etc.).
2. Digestión del ADN: Las endonucleasas de restricción se utilizan para cortar cadenas de ADN de alto peso molecular en fragmentos más pequeños. Esto se logra añadiendo la cantidad deseada de ADN, que puede variar según la sonda utilizada y la complejidad del ADN, junto con la enzima de restricción, el tampón enzimático y agua purificada. A continuación, la mezcla se incuba a 37  °C durante toda la noche.
3. Electroforesis en gel: Los fragmentos de ADN se someten a electroforesis en un gel de agarosa para separarlos por tamaño. Si algunos fragmentos de ADN son mayores de 15 kb , antes de la transferencia, el gel puede tratarse con un ácido, como HCl diluido . Esto despurina los fragmentos de ADN, dividiéndolos en trozos más pequeños, lo que permite una transferencia más eficiente del gel a la membrana.
4. Desnaturalización: Si se utilizan métodos de transferencia alcalina, el gel de ADN se coloca en una solución alcalina (generalmente hidróxido de sodio ) para desnaturalizar el ADN de doble cadena. La desnaturalización en un entorno alcalino puede mejorar la unión de los residuos de timina con carga negativa del ADN a los grupos amino con carga positiva de la membrana, separándolos en cadenas de ADN individuales para su posterior hibridación con la sonda (véase más adelante), y destruye cualquier ARN residual que pueda estar presente en el ADN. Sin embargo, la elección de métodos de transferencia alcalinos en lugar de neutros suele ser empírica y puede dar lugar a resultados equivalentes.
5. Transferencia: Se coloca una lámina de membrana de nitrocelulosa (o, alternativamente, de nailon ) encima (o debajo, según la dirección de la transferencia) del gel. Se aplica presión constante al gel (ya sea mediante succión o colocando una pila de toallas de papel y un peso sobre la membrana y el gel) para asegurar un buen contacto uniforme entre el gel y la membrana. Si la transferencia se realiza por succión, se utiliza tampón SSC 20X para asegurar el sellado y evitar que el gel se seque. A continuación, se utiliza la transferencia de tampón por acción capilar desde una región de alto potencial hídrico a una región de bajo potencial hídrico (generalmente papel de filtro y pañuelos de papel) para mover el ADN del gel a la membrana; las interacciones de intercambio iónico unen el ADN a la membrana debido a la carga negativa del ADN y la carga positiva de la membrana. Se pueden utilizar cinco métodos para transferir fragmentos de ADN a la membrana sólida, que son: ^{[ 8 ]}
   1. Transferencia capilar ascendente: Este método transfiere el fragmento de ADN desde el gel hacia arriba, hasta la membrana, donde el flujo del líquido o del tampón será ascendente.
   2. Transferencia capilar descendente: Este método se realiza colocando el gel sobre la superficie de la membrana (generalmente una membrana de nailon cargada) y los fragmentos de ADN se transferirán en dirección descendente con el flujo del tampón alcalino.
   3. Transferencia simultánea a dos membranas: Este método se utiliza para transferir fragmentos de ADN de alta concentración simultáneamente desde el gel a dos membranas.
   4. Transferencia electroforética: Este método suele utilizar una corriente eléctrica elevada, lo que dificulta la transferencia eficiente del ADN debido a la temperatura del tampón utilizado; por lo tanto, estas máquinas pueden estar equipadas con sistemas de refrigeración o utilizarse en una zona fría.
   5. Transferencia al vacío: Este método utiliza un tampón de la cámara superior para transferir el ADN del gel a la membrana de nitrocelulosa o nailon. El gel se coloca directamente sobre la membrana, y esta se coloca sobre una rejilla porosa en la cámara de vacío.
6. Inmovilización: A continuación, la membrana se hornea al vacío o en un horno convencional a 80  °C durante 2 horas (condiciones estándar; membrana de nitrocelulosa o nailon) o se expone a radiación ultravioleta (membrana de nailon) para fijar permanentemente el ADN transferido a la membrana.
7. Hibridación: Posteriormente, se expone a la membrana una sonda de hibridación —un único fragmento de ADN con una secuencia específica cuya presencia en el ADN diana se desea determinar—. El ADN de la sonda se marca para su detección, generalmente mediante la incorporación de radiactividad o el marcaje de la molécula con un colorante fluorescente o cromogénico . En algunos casos, la sonda de hibridación puede estar compuesta de ARN en lugar de ADN. Para garantizar la especificidad de la unión de la sonda al ADN de la muestra, los métodos de hibridación más comunes utilizan ADN de esperma de salmón o arenque para bloquear la superficie de la membrana y el ADN diana, formamida desionizada y detergentes como el SDS para reducir la unión inespecífica de la sonda.
8. Detección: Tras la hibridación, el exceso de sonda se elimina de la membrana mediante lavado (normalmente con tampón SSC ), y el patrón de hibridación se visualiza en una película de rayos X mediante autorradiografía en el caso de una sonda radiactiva o fluorescente, o mediante el desarrollo de color en la membrana si se utiliza un método de detección cromogénico.

La hibridación de la sonda a un fragmento de ADN específico en la membrana del filtro indica que este fragmento contiene una secuencia de ADN complementaria a la sonda. La transferencia del ADN del gel de electroforesis a la membrana facilita la unión de la sonda de hibridación marcada al ADN fraccionado por tamaño. También permite la fijación de los híbridos sonda-objetivo, necesaria para el análisis mediante autorradiografía u otros métodos de detección. Los Southern blots realizados con ADN genómico digerido con enzimas de restricción pueden utilizarse para determinar el número de secuencias (p. ej., copias de genes) en un genoma . Una sonda que se hibrida únicamente a un único segmento de ADN no cortado por la enzima de restricción producirá una sola banda en un Southern blot, mientras que es probable que se observen múltiples bandas cuando la sonda se hibride a varias secuencias muy similares (p. ej., aquellas que pueden ser el resultado de una duplicación de secuencia). Para mejorar la especificidad y reducir la hibridación de la sonda a secuencias con una identidad inferior al 100 %, se pueden modificar los parámetros de hibridación (por ejemplo, aumentando la temperatura de hibridación o disminuyendo la concentración de sal). La membrana de nailon es más duradera y tiene mayor capacidad de unión a fragmentos de ADN que la membrana de nitrocelulosa, por lo que los fragmentos de ADN se fijarán mejor a la membrana incluso cuando esta se incube a altas temperaturas. Además, en comparación con la membrana de nitrocelulosa, que requiere un tampón de alta fuerza iónica para unir los fragmentos de ADN a la membrana, las membranas cargadas de nailon utilizan tampones de muy baja fuerza iónica para transferir incluso pequeños fragmentos de ADN de aproximadamente 50 pb a la membrana. Generalmente, el ADN que se va a transferir se separa mediante gel de poliacrilamida. En el paso de transferencia, el método más eficiente para transferir el ADN del gel a la membrana es la transferencia al vacío, ya que transfiere el ADN de forma más rápida y cuantitativa. ^{[ 8 ]}

1. La transferencia Southern blot se puede utilizar para la clonación por homología basada en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen diana. Los oligonucleótidos se diseñan para que sean complementarios a la secuencia diana. Estos oligonucleótidos se sintetizan químicamente, se marcan con un isótopo radiactivo y se utilizan para analizar una biblioteca de ADN u otras colecciones de fragmentos de ADN clonados. Las secuencias que hibridan con la sonda de hibridación se analizan posteriormente, por ejemplo, para obtener la secuencia completa del gen diana.
2. Mediante esta técnica se pueden estudiar las reordenaciones cromosómicas o genéticas normales. ^{[ 7 ]}
3. Puede utilizarse para encontrar secuencias similares en otras especies o en el genoma disminuyendo la especificidad de la hibridación. ^{[ 7 ]}
4. En una mezcla que contiene ADN digerido de diferentes tamaños, se utiliza para identificar el fragmento de restricción de un tamaño específico. ^{[ 7 ]}
5. Es útil para identificar cambios que ocurren en los genes, incluyendo inserciones, reordenamientos, deleciones y mutaciones puntuales que afectan los sitios de restricción. ^{[ 7 ]}
6. Además, se utiliza para identificar una región específica que emplea muchas enzimas de restricción diferentes en un mapeo de restricción. También se utiliza para determinar qué sitio de reconocimiento se ha alterado debido a un polimorfismo de un solo nucleótido que modifica una enzima de restricción específica. ^{[ 7 ]}
7. La transferencia Southern también puede utilizarse para identificar sitios metilados en genes específicos. Resultan particularmente útiles las nucleasas de restricción MspI y HpaII , ya que ambas reconocen y cortan dentro de la misma secuencia. Sin embargo, HpaII requiere que una C dentro de ese sitio esté metilada, mientras que MspI corta solo el ADN no metilado en ese sitio. Por lo tanto, cualquier sitio metilado dentro de una secuencia analizada con una sonda específica será cortado por la primera enzima, pero no por la segunda. ^{[ 9 ]}
8. Puede utilizarse en la identificación personal mediante huellas dactilares y en el diagnóstico de enfermedades. ^{[ 10 ]}

1. En comparación con otras pruebas, el Southern blot es una técnica compleja que consta de múltiples pasos y estos pasos requieren equipos y reactivos costosos. ^{[ 10 ]}
2. Se necesita ADN de alta calidad y en grandes cantidades. ^{[ 10 ]}
3. La transferencia Southern es un método que consume mucho tiempo y solo puede estimar el tamaño del ADN, ya que es un método semicuantitativo. ^{[ 10 ]}
4. No se puede utilizar para detectar mutaciones a nivel de pares de bases. ^{[ 10 ]}

• Electroforesis en gel de ácidos nucleicos
• Fragmento de restricción
• Huella genética
• Northern blot
• Western blot
• Eastern blot
• mancha del suroeste
• mancha del noroeste

• OpenWetWare