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Ensayo de estructura de la cromatina espermática

El ensayo de estructura de cromatina espermática (SCSA) es un método diagnóstico que detecta anomalías espermáticas con un alto grado de fragmentación del ADN . [ 1 ] Descrito p...

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El ensayo de estructura de cromatina espermática (SCSA) es un método diagnóstico que detecta anomalías espermáticas con un alto grado de fragmentación del ADN . [ 1 ] Descrito por primera vez por Evenson en 1980, el ensayo es una prueba de citometría de flujo que detecta la vulnerabilidad del ADN espermático a la desnaturalización del ADN in situ inducida por ácido . [ 2 ] El SCSA mide la fragmentación del ADN espermático atribuida a factores intrínsecos y extrínsecos e informa el grado de fragmentación en términos del Índice de Fragmentación del ADN (DFI). El uso del SCSA se extiende desde la evaluación de la infertilidad y subfertilidad masculina , estudios toxicológicos y evaluación de la calidad de muestras de semen de laboratorio . Cabe destacar que el SCSA supera a otros ensayos convencionales de fragmentación del ADN espermático (sDF), como TUNEL y COMET, en términos de eficiencia, objetividad y repetibilidad.

Representación esquemática del SCSA. Uso de la citometría de flujo para diferenciar espermatozoides intactos de espermatozoides defectuosos. Un haz láser incide sobre cada espermatozoide. Un tubo fotomultiplicador identifica y cuantifica los resultados.

Historia

Antes del desarrollo de SCSA, el diagnóstico o pronóstico de la infertilidad / subfertilidad masculina se basaba principalmente en los parámetros seminales del manual de la Organización Mundial de la Salud (OMS) , [ 3 ] incluyendo la concentración , motilidad y morfología del semen . Sin embargo, varios informes de fallos en el embarazo presentaban parámetros dentro del rango normal, lo que sugiere que ninguna de estas mediciones ha llegado a una conclusión fiable para reflejar la probabilidad de fertilidad de una pareja. [ 4 ] Además, dichos parámetros suelen estar asociados a una alta intensidad de trabajo y falta de potencia estadística .

A finales de la década de 1970, Donald P. Evenson, del Memorial Sloan Kettering Cancer Center en Estados Unidos, recibió una beca de investigación del NIH (RO1) para el estudio de la estructura de la cromatina del esperma de mamíferos . [ 5 ] [ 6 ] Desde entonces, se han adoptado diversas técnicas para acceder a la integridad del ADN del esperma. En particular, la microscopía electrónica de transmisión reflejó una cantidad significativa de heterogeneidad de la cromatina del esperma. [ 4 ] [ 7 ]

La heterogeneidad se confirmó luego mediante citometría de flujo contrastando los resultados de tinción AO entre núcleos de espermatozoides humanos y de ratón . Se observaron resultados homogéneos en la muestra de ratón, mientras que la intensidad de fluorescencia heterogénea varió entre la muestra humana. Se propuso una hipótesis: " la fragmentación del ADN espermático inducida por roturas de ADN de cadena simple/doble está correlacionada con la infertilidad masculina ". [ 4 ] [ 5 ] En 1980, Evenson et al. publicaron artículos que sintetizan este conocimiento en pruebas clínicas y encontraron SCSA.

Inicialmente, se propuso y empleó la utilización de energía térmica en tampón (100 °C, 5 min) para la desnaturalización del ADN en los sitios de daño del ADN. [ 8 ] Sin embargo, el protocolo de calentamiento del esperma era laborioso e inducía la pérdida aleatoria de la muestra de esperma. Por lo tanto, la desnaturalización inducida por ácido ha reemplazado a la desnaturalización inducida por calor debido a la mayor conveniencia de la técnica de pH bajo y la similitud en los resultados. [ 5 ] 

Principio

SCSA es una herramienta de diagnóstico ampliamente utilizada para la detección de muestras de esperma con un alto grado de fragmentación del ADN y ausencia de intercambio de proteínas histona - protamina en los núcleos espermáticos . [ 9 ] SCSA define la anormalidad espermática como una mayor vulnerabilidad del ADN espermático a la desnaturalización inducida por calor/ácido in situ . [ 4 ] Teóricamente, un núcleo espermático completamente maduro y sano , rico en enlaces disulfuro (SS) , debería tener su ADN preservado en forma de doble cadena . [ 5 ] Un tratamiento de pH bajo abre el ADN espermático defectuoso en los sitios de daño. Mediante la tinción con naranja de acridina (AO) , las moléculas de AO se intercalan en el ADN de doble cadena en los espermatozoides intactos, mientras que la agregación de moléculas de AO ocurre en el ADN de cadena simple en los espermatozoides defectuosos. [ 4 ] [ 5 ] Al someterse a citometría de flujo (luz azul), se emitirá fluorescencia verde (ADN nativo) y roja (ADN dañado) de los espermatozoides intactos y defectuosos, respectivamente. [ 2 ] [ 4 ] [ 10 ] Las señales se analizarán con programación de software para examinar tanto la fragmentación del ADN del esperma (sDF) como la estructura atípica de la cromatina.

Causas del daño al ADN de los espermatozoides

La integridad del ADN del espermatozoide está estrechamente relacionada con la transferencia del ADN paterno al ovocito durante la fecundación . La etiología del daño al ADN del espermatozoide se puede subdividir en factores intrínsecos y extrínsecos. Los primeros se atribuyen a una serie de fenómenos fisiopatológicos durante la espermatogénesis ; los segundos son causados ​​por la exposición posnatal a fuentes endógenas de roturas del ADN.

Factores intrínsecos

Factores extrínsecos

  • Edad: Aunque los hombres producen esperma durante toda su edad adulta , la edad avanzada se asocia con un mayor número de roturas de doble cadena de ADN y una menor frecuencia de apoptosis espermática . [ 13 ] Esta observación implica un deterioro de la selección, la calidad y la integridad del esperma. [ 20 ]
  • Estrés térmico : Las altas temperaturas provocan efectos adversos en el ADN de los espermatozoides y la fertilidad masculina . El calor excesivo se relaciona con una alteración de la integridad de la cromatina espermática , [ 21 ] y el sobrecalentamiento testicular se asocia con una reducción del potencial de fertilidad. [ 22 ]
  • Tabaquismo : Las toxinas presentes en los tabacos comunes pueden aumentar la prevalencia de ADN fragmentado . [ 4 ] El tabaquismo se asocia con niveles significativamente elevados de ROS seminales y estrés oxidativo . [ 23 ] El aumento de la actividad de ROS conduce a la apoptosis y a una mayor fragmentación del ADN. [ 16 ]

Procedimiento

Actualmente, solo el protocolo SCSA desarrollado por Evenson et al. ha recibido protección de marca registrada para lograr relevancia clínica entre diferentes laboratorios. [ 4 ] Los pasos individuales del SCSA son los siguientes:

  1. Congelación / Descongelación : Después de la eyaculación , las muestras de esperma humano se someten a una licuefacción de semen de 30 minutosa 37 °C, seguida de criopreservación en un congelador de temperatura ultrabaja (–70 a –110 °C) o se colocan directamente en crioviales de nitrógeno líquido . [ 24 ] Las muestras de esperma congeladas o frescas se descongelan en un baño de agua a 37 °C y se diluyen con un tampón TNE para obtener una suspensión de 200 μL (concentración de esperma: 1-2 x 10^6 mL). [ 24 ]
  2. Desnaturalización inducida por ácido : se añaden 400 μL de solución ácida ( pH 1,2) que contiene solución de cloruro de sodio 0,15 M, ácido clorhídrico Tris 0,08 M ​​y Triton-X 100 al 0,1 % a 200 μL de suspensión de esperma, [ 4 ] [ 24 ] y la solución se mezcla estrictamente durante 30 segundos. Este proceso permite la desnaturalización de los núcleos de los espermatozoides con daño en el ADN .
  3. Tinción con naranja de acridina (AO) :  A continuación, se añaden1,20 ml de solución de tinción de AO con 6 μg de AO/ml de tampón de tinción a la mezcla. [ 4 ] [ 24 ] Las pequeñas moléculas de AO penetran a través de la cromatina del esperma para acceder al ADN de doble cadena y al ADN de cadena simple en los núcleos de espermatozoides intactos y defectuosos, respectivamente.
  4. Citometría de flujo (FCM) : Mediante un citómetro de flujo , se pueden examinar de 500 a 1000 espermatozoides en minutos en una escala de gradación de 1024 x 1024 a través de un parámetro dual. [ 9 ] Visualizado bajo luz azul en longitudes de onda de 450-490 nm, el ADN de doble cadena de espermatozoides intactos emite fluorescencia verde (488 nm), mientras que la agregación de moléculas de AO en el ADN de cadena simple de espermatozoides defectuosos produce un cambio metacromático a fluorescencia roja (>630 nm). [ 9 ] [ 4 ]
  5. Análisis de datos : Se generaráun diagrama de dispersión (citograma) a partir del citómetro de flujo que refleja la tinción del ADN a partir de puntos rojos (eje X) y verdes (eje Y) para identificar la heterogeneidad ; [ 9 ] Con el software SCSAsoft®, los datos del diagrama de dispersión se convertirán en histogramas de frecuencia para el cálculo del índice de fragmentación del ADN (DFI) / Células fuera del pico principal de αt (COMPαt), alfa t (αt) y fracción de ADN altamente teñible (HDS). [ 4 ] [ 5 ]

Parámetros

SCSA consta de un protocolo de citometría de flujo fijo y un programa informático específico, SCSAsoft®. Las mediciones incluyen el índice de fragmentación del ADN (DFI) y la fracción de ADN altamente teñible (HDS), que representan el porcentaje de espermatozoides con roturas de ADN / defectos de protamina y espermatozoides inmaduros sin protaminación completa, respectivamente. [ 10 ]

índice de fragmentación del ADN (DFI)

También conocido como Células Fuera del Pico Principal de αt (COMPαt), el DFI se puede subclasificar en DFI medio (X DFI) y DFI de desviación estándar (SD DFI). [ 5 ] El índice se ha determinado como el criterio más sensible para la evaluación de la fertilidad en cuanto a la integridad del ADN espermático. Un DFI normal implica que no hay un valor medible; una muestra con DFI moderado sugiere una morfología espermática normal ; y las fracciones con DFI alto exhibieron núcleos alargados y signos de apoptosis . En general, cuanto mayor sea el DFI, mayor será la probabilidad de infertilidad o subfertilidad.

Dentro de un DFI de 0-20%, la ocurrencia de embarazo espontáneo se mantiene constante; [ 2 ] cuando el DFI supera el 20%, la tasa de fertilidad natural disminuye gradualmente; [ 2 ] cuando el DFI supera el 30%, la razón de probabilidades de fertilidad natural o por inseminación intrauterina (IIU) se reduce considerablemente entre 8 y 10 veces, lo que sugiere una probabilidad de embarazo cercana a cero . [ 2 ]

Fracción de ADN altamente teñible (HDS)

La población de espermatozoides HDS presenta un grado notablemente alto de tinción de ADN por moléculas de AO debido a la presencia de protaminas P2 no procesadas . [ 9 ] [ 25 ] La determinación del valor HDS refleja anomalías estructurales de la cromatina. Un valor HDS alto indica una morfología espermática inmadura y, por lo tanto, un fallo en el embarazo. [ 25 ] [ 26 ]

Aplicaciones

Diagnóstico de infertilidad o subfertilidad masculina

Dado que el análisis de semen se puede realizar para evaluar las anomalías en los espermatozoides, es un instrumento válido para determinar la infertilidad o subfertilidad masculina .

Aunque las causas y los eventos que desencadenan el daño y la fragmentación del ADN espermático aún no se comprenden del todo, se ha demostrado que la fragmentación del ADN espermático está estrechamente correlacionada con la fertilidad y la subfertilidad no solo en humanos, sino también en toros, verracos y sementales. [ 5 ] [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] Este hallazgo afirma que el DFI determinado por SCSA es un predictor independiente sólido de embarazo in vivo y una técnica clínicamente útil. [ 13 ] [ 23 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 8 ]

Actualmente, el 25 % de DFI es el umbral clínico establecido para clasificar a los varones según la probabilidad estadística de: 1) mayor tiempo para un embarazo natural, 2) menor probabilidad de éxito en la inseminación intrauterina (IIU) , 3) mayor riesgo de aborto espontáneo o 4) infertilidad . Los valores altos de HDS se correlacionan positivamente con los fallos en el embarazo .

En tales casos, se pueden realizar otras técnicas de reproducción asistida (TRA) , incluyendo la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (para muestras de esperma con DFI > 25%) o la extracción de espermatozoides testiculares (TESE) (para muestras de esperma con DFI > 50%). [ 9 ]

Estudios toxicológicos

El daño al ADN de los espermatozoides puede atribuirse a la exposición a quimioterapia , radioterapia u otros tóxicos ambientales . SCSA es altamente sensible a la dosis de fragmentación del ADN de los espermatozoides inducida por tóxicos químicos. [ 13 ] Por lo tanto, SDαt es la variable más importante para los estudios de toxicología .

Evaluación del semen almacenado en frío

El análisis SCSA también se realiza para evaluar la calidad de muestras de esperma de laboratorio que se han almacenado durante al menos 24 horas. Las muestras de semen que se han almacenado en condiciones adecuadas no presentarán prácticamente ningún cambio, mientras que un cambio mayor en la calidad del ADN indica una manipulación inadecuada. [ 32 ]

Ventajas

SCSA tiene numerosas ventajas en comparación con otros ensayos de fragmentación del ADN espermático (sDF) [Ensayo TUNEL , ensayo COMET y dispersión de cromatina espermática (SCD), que incluyen:

  • Más eficiente en tiempo y costo: se pueden analizar de 5000 a 10000 espermatozoides en menos de 5 minutos. [ 5 ] [ 4 ] La eficiencia es mayor que la de cualquier otro protocolo de fragmentación de espermatozoides existente. Además, los requisitos de equipo y reactivos son relativamente bajos. Solo se requieren 10 centavos por prueba para los reactivos necesarios. [ 9 ]
  • Mayor objetividad y precisión : El análisis de esperma convencional incluye el recuento , la morfología y la motilidad de los espermatozoides para determinar la infertilidad o subfertilidad . Sin embargo, varios informes de fallos en el embarazo mostraron que los parámetros mencionados se encontraban dentro del rango normal. [ 4 ] Para SCSA, se miden los valores de DFI y HDS guiados por máquina con un umbral imparcial en lugar de la evaluación subjetiva a simple vista, lo que resulta en una mayor precisión (pruebas de coeficiente de variación, CV del 1-3%).
  • Mayor repetibilidad : Dado que el recuento , la morfología y la motilidad de los espermatozoides en las muestras de semen fluctúan en un corto período de tiempo, los resultados del análisis son menos repetibles. El SCSA tiene una repetibilidad de 0,98-0,99 en entornos clínicos. A menos que se produzcan alteraciones por diferentes estilos de vida o intervenciones médicas , los resultados experimentales son reproducibles. [ 9 ] [ 4 ] [ 13 ]

Limitaciones

A pesar de los datos objetivos y las ventajas que ofrece, la eficacia del SCSA en la evaluación de la fertilidad sigue siendo cuestionada clínicamente. Entre las limitaciones sugeridas se incluyen:

Referencias

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