polimerasa Taq

La polimerasa Taq es una ADN polimerasa termoestable que recibe su nombre delmicroorganismo eubacteriano termófilo Thermus aquaticus , del cual fue aislada originalmente por la estudiante de maestría Alice Chien et al. en 1976. ^{[ 1 ]} Su nombre se abrevia a menudo como Taq o Taq pol . Se utiliza frecuentemente en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método para amplificar en gran medida la cantidad de segmentos cortos de ADN .

T. aquaticus es una bacteria que vive en fuentes termales y respiraderos hidrotermales , y la polimerasa Taq fue identificada ^{[ 1 ]} como una enzima capaz de soportar las condiciones de desnaturalización de proteínas (alta temperatura) requeridas durante la PCR. ^{[ 2 ]} Por lo tanto, reemplazó a la ADN polimerasa de E. coli utilizada originalmente en la PCR. ^{[ 3 ]}

La temperatura óptima de Taq para su actividad es de 75–80  °C, con una vida media de más de 2 horas a 92,5  °C, 40 minutos a 95  °C y 9 minutos a 97,5  °C, y puede replicar una cadena de ADN de 1000 pares de bases en menos de 10 segundos a 72  °C. ^{[ 4 ]} A 75–80  °C, Taq alcanza su tasa de polimerización óptima de aproximadamente 150 nucleótidos por segundo por molécula de enzima, y ​​cualquier desviación del rango de temperatura óptimo inhibe la tasa de extensión de la enzima. Una sola Taq sintetiza aproximadamente 60 nucleótidos por segundo a 70  °C, 24 nucleótidos/seg a 55  °C, 1,5 nucleótidos/seg a 37  °C y 0,25 nucleótidos/seg a 22  °C. A temperaturas superiores a 90  °C, la Taq muestra muy poca o ninguna actividad, pero la enzima en sí no se desnaturaliza y permanece intacta. ^{[ 5 ]} La presencia de ciertos iones en el recipiente de reacción también afecta la actividad específica de la enzima. Pequeñas cantidades de cloruro de potasio (KCl) e ion magnesio (Mg ²⁺ ) promueven la Taqactividad enzimática de la Taq polimerasa . La Taq polimerasa se activa al máximo a 50 mM de KCl, mientras que la concentración óptima de Mg ²⁺ está determinada por la concentración de nucleósidos trifosfato (dNTP). Las altas concentraciones de KCl y Mg ²⁺ inhiben la Taqactividad de. ^{[ 6 ]} El quelante común de iones metálicos EDTA se une directamente a Taq en ausencia de estos iones metálicos. ^{[ 7 ]}

Una de las desventajas de Taq es su falta de actividad de corrección de pruebas de exonucleasa 3' a 5' ^{[ 4 ],} lo que resulta en una fidelidad de replicación relativamente baja. Originalmente, su tasa de error se midió en aproximadamente 1 en 9000 nucleótidos. ^{[ 8 ]} Se han aislado algunas ADN polimerasas termoestables de otras bacterias y arqueas termófilas, como la ADN polimerasa Pfu , que poseen actividad de corrección de pruebas, y se están utilizando en lugar de (o en combinación con) Taq para la amplificación de alta fidelidad. ^{[ 9 ]} La fidelidad puede variar ampliamente entre las Taq, lo que tiene profundos efectos en las aplicaciones de secuenciación posteriores. ^{[ 10 ]}

La enzima Taq produce ADN con extremos 3' sobresalientes de adenina (A). Esto puede ser útil en la clonación TA , donde se utiliza un vector de clonación (como un plásmido ) con un extremo 3' sobresaliente de timina (T ), que se complementa con el extremo sobresaliente de adenina del producto de PCR, permitiendo así la ligación del producto de PCR al vector plasmídico.

A principios de la década de 1980, Kary Mullis trabajaba en Cetus Corporation en la aplicación de ADN sintético a la biotecnología . Estaba familiarizado con el uso de oligonucleótidos de ADN como sondas para la unión a cadenas de ADN objetivo, así como con su uso como cebadores para la secuenciación de ADN y la síntesis de ADNc . En 1983, comenzó a utilizar dos cebadores, uno para hibridar con cada cadena de un ADN objetivo, y a añadir ADN polimerasa a la reacción. Esto condujo a una replicación exponencial del ADN , ^{[ 11 ]} amplificando enormemente segmentos discretos de ADN entre los cebadores. ^{[ 3 ]}

Sin embargo, tras cada ronda de replicación, la mezcla debe calentarse por encima de 90  °C para desnaturalizar el ADN recién formado, permitiendo que las hebras se separen y actúen como moldes en la siguiente ronda de amplificación. Este calentamiento también inactiva la ADN polimerasa que se utilizaba antes del descubrimiento de la polimerasa Taq , el fragmento de Klenow (obtenido de E. coli ). La polimerasa Taq es idónea para esta aplicación, ya que puede soportar la temperatura de 95  °C necesaria para la separación de las hebras de ADN sin desnaturalizarse.

El uso de la Taq termoestable permite realizar la PCR a alta temperatura (~60  °C o más), lo que facilita una alta especificidad de los cebadores y reduce la producción de productos inespecíficos, como el dímero de cebadores . Además, el uso de una polimerasa termoestable elimina la necesidad de añadir enzima nueva en cada ciclo de termociclado. Un solo tubo cerrado en un equipo relativamente sencillo puede utilizarse para llevar a cabo todo el proceso. Por lo tanto, el uso de la polimerasa Taq fue la idea clave que hizo que la PCR fuera aplicable a una gran variedad de problemas de biología molecular relacionados con el análisis de ADN. ^{[ 2 ]}

Hoffmann-La Roche finalmente compró las patentes de PCR y Taq a Cetus por 330 millones de dólares, de los cuales pudo haber recibido hasta 2 mil millones de dólares en regalías. ^{[ 12 ]} En 1989, la revista Science nombró a la polimerasa Taq su primera " Molécula del Año ". Kary Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993, el único otorgado por una investigación realizada en una empresa de biotecnología . A principios de la década de 1990, la técnica de PCR con polimerasa Taq se utilizaba en muchas áreas, incluyendo la investigación básica en biología molecular, las pruebas clínicas y la medicina forense . También comenzó a encontrar una aplicación urgente en la detección directa del VIH en el SIDA . ^{[ 13 ]}

En diciembre de 1999, el juez de distrito estadounidense Vaughn Walker dictaminó que la patente de 1990 relativa a la polimerasa Taq se había emitido, en parte, con base en información engañosa y afirmaciones falsas por parte de científicos de Cetus Corporation . El fallo respaldó la impugnación presentada por Promega Corporation contra Hoffman-La Roche , que había adquirido las patentes de Taq en 1991. El juez Walker citó descubrimientos previos de otros laboratorios, incluido el laboratorio de John Trela ​​en el departamento de ciencias biológicas de la Universidad de Cincinnati , como fundamento del fallo. ^{[ 14 ]}

La Taq Pol A tiene una estructura general similar a la de la PolA de E. coli . El dominio exonucleasa 3'–5' central, responsable de la corrección de errores, ha sufrido cambios drásticos y no es funcional. ^{[ 15 ]} Posee un dominio exonucleasa 5'-3' funcional en el extremo amino terminal, descrito a continuación.

Mutantes

Se ha informado de un experimento de mutagénesis dirigida que mejora la actividad exonucleasa 3'-5' vestigial en un factor de 2, pero nunca se informó si esto disminuye la tasa de error. ^{[ 19 ]} Siguiendo una línea de pensamiento similar, se han creado proteínas quiméricas seleccionando dominios de E. coli , Taq y polimerasa I de T. neapolitana . El intercambio del dominio vestigial por uno funcional de E. coli creó una proteína con capacidad de corrección de errores, pero con una temperatura óptima más baja y baja termoestabilidad. ^{[ 20 ]}

Se han producido versiones de la polimerasa sin el dominio exonucleasa 5'-3', entre las que destacan Klentaq y el fragmento de Stoffel . La ausencia total de actividad exonucleasa hace que estas variantes sean adecuadas para cebadores que presentan estructura secundaria, así como para la copia de moléculas circulares. ^{[ 9 ]} Otras variaciones incluyen el uso de Klentaq con una polimerasa de alta fidelidad, una termosecuenciasa que reconoce sustratos como la ADN polimerasa T7 , mutantes con mayor tolerancia a los inhibidores o versiones "marcadas en el dominio" que poseen un motivo hélice-horquilla-hélice adicional alrededor del sitio catalítico para sujetar el ADN con mayor firmeza a pesar de las condiciones adversas. ^{[ 21 ]}