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polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal

El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal ( TRFLP o, a veces , T-RFLP ) es una técnica de biología molecular para el análisis de comunidades microbianas ...

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El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal ( TRFLP o, a veces , T-RFLP ) es una técnica de biología molecular para el análisis de comunidades microbianas basada en la posición de un sitio de restricción más cercano al extremo marcado de un gen amplificado. El método se basa en la digestión de una mezcla de variantes amplificadas por PCR de un solo gen utilizando una o más enzimas de restricción y la detección del tamaño de cada uno de los fragmentos terminales resultantes mediante un secuenciador de ADN . El resultado es una gráfica donde el eje x representa el tamaño del fragmento y el eje y su intensidad de fluorescencia.

Fondo

TRFLP es uno de varios métodos moleculares destinados a generar una huella dactilar de una comunidad microbiana desconocida. Otros métodos similares incluyen DGGE, TGGE , ARISA , ARDRA , PLFA , etc. Estos métodos de alto rendimiento se desarrollaron para reducir el costo y el esfuerzo en el análisis de comunidades microbianas utilizando una biblioteca de clones . El método fue descrito por primera vez por Avaniss-Aghajani et al. en 1994 [ 1 ] y posteriormente por Liu en 1997 [ 2 ] , quienes emplearon la amplificación del gen diana 16S rDNA del ADN de varias bacterias aisladas, así como de muestras ambientales. Desde entonces, el método se ha aplicado para el uso de otros genes marcadores, como el gen marcador funcional pmoA, para analizar comunidades metanotróficas.

Método

Al igual que la mayoría de los métodos de análisis de comunidades, TRFLP también se basa en la amplificación por PCR de un gen diana. En el caso de TRFLP, la amplificación se realiza con uno o ambos cebadores marcados en su extremo 5' con una molécula fluorescente. Si ambos cebadores están marcados, se requieren diferentes colorantes fluorescentes . Si bien se pueden usar varios colorantes fluorescentes comunes para el marcaje, como 6-carboxifluoresceína (6-FAM), ROX, carboxitetrametilrodamina (TAMRA, un colorante a base de rodamina ) y hexaclorofluoresceína (HEX), el colorante más utilizado es 6-FAM. La mezcla de amplicones se somete a una reacción de restricción, normalmente utilizando una enzima de restricción de cuatro cortes . Tras la reacción de restricción, la mezcla de fragmentos se separa mediante electroforesis capilar o de poliacrilamida en un secuenciador de ADN y el tamaño de los diferentes fragmentos terminales se determina mediante un detector de fluorescencia . Debido a que la mezcla de amplicones extraídos se analiza en un secuenciador, solo se leen los fragmentos terminales (es decir, el extremo o los extremos marcados del amplicón), mientras que todos los demás fragmentos se ignoran. Por lo tanto, T-RFLP difiere de ARDRA y RFLP, en los que se visualizan todos los fragmentos de restricción. Además de estos pasos, el protocolo TRFLP suele incluir una purificación de los productos de PCR antes de la restricción y, en caso de utilizarse una electroforesis capilar, también se realiza una etapa de desalación antes de procesar la muestra.

Formato de datos y artefactos

El resultado de un perfilado T-RFLP es un gráfico llamado electroferograma, que es una representación gráfica de la intensidad de un experimento de electroforesis (en gel o capilar). En un electroferograma, el eje X marca el tamaño de los fragmentos, mientras que el eje Y marca la intensidad de fluorescencia de cada fragmento. Así, lo que aparece en un gel de electroforesis como una banda aparece como un pico en el electroferograma, cuya integral es su fluorescencia total. En un perfil T-RFLP, se supone que cada pico corresponde a una variante genética en la muestra original, mientras que su altura o área corresponde a su abundancia relativa en la comunidad específica. Sin embargo, no siempre se cumplen ambas suposiciones. A menudo, varias bacterias diferentes en una población pueden dar un solo pico en el electroferograma debido a la presencia de un sitio de restricción para la enzima de restricción particular utilizada en el experimento en la misma posición. Para superar este problema y aumentar el poder de resolución de esta técnica, una sola muestra puede ser digerida en paralelo por varias enzimas (a menudo tres), lo que da como resultado tres perfiles T-RFLP por muestra, cada uno resolviendo algunas variantes y omitiendo otras. Otra modificación que a veces se utiliza consiste en marcar fluorescentemente también el cebador inverso con un colorante diferente, lo que da como resultado dos perfiles paralelos por muestra, cada uno de los cuales resuelve un número diferente de variantes.

Además de la convergencia de dos variantes genéticas distintas en un único pico, también pueden aparecer artefactos, principalmente en forma de picos falsos. Los picos falsos son generalmente de dos tipos: "ruido" de fondo y TRF "pseudo". [ 3 ] Los picos de fondo (ruido) son picos que resultan de la sensibilidad del detector en uso. Estos picos suelen ser pequeños en su intensidad y generalmente forman un problema si la intensidad total del perfil es baja (es decir, baja concentración de ADN). Debido a que estos picos resultan del ruido de fondo, normalmente son irreproducibles en perfiles replicados, por lo que el problema se puede abordar produciendo un perfil de consenso a partir de varias réplicas o eliminando los picos por debajo de un cierto umbral. También se introdujeron varias otras técnicas computacionales para abordar este problema. [ 4 ] Los TRF pseudo, por otro lado, son picos reproducibles y son lineales a la cantidad de ADN cargado. Se cree que estos picos son el resultado del apareamiento del ADN monocatenario consigo mismo, creando sitios de restricción aleatorios de doble cadena que posteriormente son reconocidos por la enzima de restricción, dando lugar a un fragmento terminal que no representa ninguna variante genética genuina. Se ha sugerido que la aplicación de una exonucleasa de ADN , como la exonucleasa de frijol mungo, antes de la etapa de digestión podría eliminar este artefacto.

Interpretación de datos

Los datos resultantes del electroferograma se interpretan normalmente de una de las siguientes maneras.

Comparación de patrones

En la comparación de patrones, se comparan las formas generales de los electroferogramas de diferentes muestras para detectar cambios como la presencia o ausencia de picos entre los tratamientos, su tamaño relativo, etc.

Complementando con una biblioteca de clones

Si se construye una biblioteca de clones en paralelo al análisis T-RFLP, estos clones pueden utilizarse para evaluar e interpretar el perfil T-RFLP. En este método, el TRF de cada clon se determina directamente (es decir, realizando un análisis T-RFLP en cada clon individual) o mediante un análisis in silico de su secuencia. Al comparar el perfil T-RFLP con la biblioteca de clones, es posible validar la autenticidad de cada pico y evaluar la abundancia relativa de cada variante en la biblioteca.

Resolución de picos mediante una base de datos

Varias aplicaciones informáticas intentan relacionar los picos de un electroferograma con bacterias específicas en una base de datos. Normalmente, este tipo de análisis se realiza resolviendo simultáneamente varios perfiles de una misma muestra obtenidos con diferentes enzimas de restricción. El software resuelve el perfil intentando maximizar las coincidencias entre los picos de los perfiles y las entradas de la base de datos, de modo que el número de picos sin una secuencia coincidente sea mínimo. El software extrae de la base de datos únicamente aquellas secuencias cuyos TRF se encuentran en todos los perfiles analizados.

Análisis multivariado

Una forma cada vez más extendida de analizar los perfiles T-RFLP es mediante métodos estadísticos multivariados para interpretar los datos T-RFLP. [ 5 ] Por lo general, los métodos aplicados son los comúnmente utilizados en ecología y, especialmente, en el estudio de la biodiversidad. Entre ellos, las ordenaciones y el análisis de conglomerados son los más utilizados. Para realizar un análisis estadístico multivariado de los datos T-RFLP, estos deben convertirse primero en una tabla conocida como "tabla de muestras por especies", que representa las diferentes muestras (perfiles T-RFLP) frente a las especies (T-RFS) con la altura o el área de los picos como valores.

Ventajas y desventajas

Dado que T-RFLP es una técnica de huella digital, sus ventajas e inconvenientes se suelen analizar en comparación con otras técnicas similares, principalmente DGGE.

Ventajas

La principal ventaja de T-RFLP radica en el uso de un secuenciador automatizado que proporciona resultados altamente reproducibles para muestras repetidas. Si bien los perfiles genéticos no son completamente reproducibles y algunos picos menores que aparecen resultan irreproducibles, la forma general del electroferograma y las proporciones de los picos principales se consideran reproducibles. El uso de un secuenciador automatizado que genera los resultados en formato numérico digital también facilita el almacenamiento de los datos y la comparación de diferentes muestras y experimentos. El formato numérico de los datos puede utilizarse, y de hecho se ha utilizado, para la cuantificación relativa (aunque no absoluta) y el análisis estadístico. Aunque los datos de secuencia no pueden inferirse de forma definitiva directamente del perfil T-RFLP, es posible, hasta cierto punto, la asignación "in silico" de los picos a secuencias existentes.

Desventajas

Debido a que T-RFLP se basa en métodos de extracción de ADN y PCR, los sesgos inherentes a ambos afectarán los resultados del análisis. [ 6 ] [ 7 ] Además, el hecho de que solo se lean los fragmentos terminales significa que dos secuencias distintas que compartan un sitio de restricción terminal darán como resultado un solo pico en el electroferograma y serán indistinguibles. De hecho, cuando se aplica T-RFLP a una comunidad microbiana compleja, el resultado suele ser una compresión de la diversidad total a normalmente 20-50 picos distintos, cada uno de los cuales representa un número desconocido de secuencias distintas. Si bien este fenómeno facilita el manejo de los resultados de T-RFLP, naturalmente introduce sesgos y una simplificación excesiva de la diversidad real. Los intentos de minimizar (pero no superar) este problema a menudo se realizan aplicando varias enzimas de restricción y/o marcando ambos cebadores con un colorante fluorescente diferente. La imposibilidad de recuperar secuencias de T-RFLP a menudo lleva a la necesidad de construir y analizar una o más bibliotecas de clones en paralelo al análisis de T-RFLP, lo que aumenta el esfuerzo y complica el análisis. La posible aparición de T-RF falsos (pseudo-RF), como se mencionó anteriormente, es otro inconveniente. Para solucionar esto, los investigadores suelen considerar únicamente los picos que pueden asociarse a secuencias en una biblioteca de clones.

Referencias

  1. ↑ Avaniss-Aghajani, E; Jones, K; Chapman, D; Brunk, C (1994). "Una técnica molecular para la identificación de bacterias utilizando secuencias de ARN ribosómico de subunidad pequeña". BioTechniques . 17 (1): 144– 149. PMID 7946297 . 
  2. ↑ Liu, W; Marsh, T; Cheng, H; Forney, L (1997). "Caracterización de la diversidad microbiana mediante la determinación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción terminales de genes que codifican el ARNr 16S" . Appl . Environ. Microbiol . 63 (11): 4516– 4522. Bibcode : 1997ApEnM..63.4516L . doi : 10.1128/AEM.63.11.4516-4522.1997 . PMC 168770. PMID 9361437 .  
  3. ↑ Egert, M; Friedrich, MW (2003). "Formación de fragmentos de restricción pseudoterminales, un sesgo relacionado con la PCR que afecta el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminales de la estructura de la comunidad microbiana" . Appl . Environ. Microbiol . 69 (5): 2555– 2562. Bibcode : 2003ApEnM..69.2555E . doi : 10.1128/aem.69.5.2555-2562.2003 . PMC 154551. PMID 12732521 .  
  4. ↑ Dunbar, J; Ticknor, LO; Kuske, CR (2001). "Especificidad filogenética y reproducibilidad y nuevo método para el análisis de perfiles de fragmentos de restricción terminales de genes de ARNr 16S de comunidades bacterianas" . Appl . Environ. Microbiol . 67 (1): 190– 197. Bibcode : 2001ApEnM..67..190D . doi : 10.1128/aem.67.1.190-197.2001 . PMC 92545. PMID 11133445 .  
  5. ↑ Abdo, Zaid; et al. (2006). "Métodos estadísticos para caracterizar la diversidad de comunidades microbianas mediante el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción terminales de genes de ARNr 16S". Microbiología ambiental . 8 (5): 929– 938. Bibcode : 2006EnvMi...8..929A . doi : 10.1111/j.1462-2920.2005.00959.x . PMID 16623749 .  
  6. ↑ Brooks, JP; Edwards, David J.; Harwich, Michael D.; Rivera, Maria C.; Fettweis, Jennifer M.; Serrano, Myrna G.; Reris, Robert A.; Sheth, Nihar U.; Huang, Bernice (2015-03-21). "La verdad sobre la metagenómica: cuantificación y contrarrestación del sesgo en los estudios de ARNr 16S" . BMC Microbiology . 15 (1): 66. doi : 10.1186/ s12866-015-0351-6 . ISSN 1471-2180 . PMC 4433096. PMID 25880246 .   
  7. ↑ Sharifian, Hoda (mayo de 2010). "Errores inducidos durante la amplificación por PCR" (PDF) .
  • Protocolo mejorado para T-RFLP mediante electroforesis capilar
  • Métodos estadísticos para caracterizar la diversidad de comunidades microbianas mediante el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción terminales de genes de ARNr 16S.
  • FragSort : Un software para la asignación "in silico" de perfiles T-RFLP de la Universidad Estatal de Ohio.
  • Análisis T-RFLP (APLAUS+) : Otra herramienta de análisis "in silico" disponible en el sitio web del proyecto de Análisis de Comunidades Microbianas de la Universidad de Idaho.
  • BEsTRF: una herramienta para la resolución óptima del análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal basada en bases de datos de secuencias de cebadores-enzimas definidas por el usuario.
  • LA PRIMERA DÉCADA DE POLIMORFISMO DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN TERMINAL (T-RFLP) EN ECOLOGÍA MICROBIANA