Transposasa

Una transposasa es cualquier enzima capaz de unirse al extremo de un transposón y catalizar su movimiento a otra parte del genoma , generalmente mediante un mecanismo de corte y pegado o un mecanismo replicativo, en un proceso conocido como transposición. La palabra "transposasa" fue acuñada por quienes clonaron la enzima necesaria para la transposición del transposón Tn3 . ^{[ 1 ]} La existencia de transposones fue postulada a finales de la década de 1940 por Barbara McClintock , quien estudiaba la herencia del maíz , pero la base molecular real de la transposición fue descrita por grupos posteriores. McClintock descubrió que algunos segmentos de los cromosomas cambiaban de posición, saltando entre diferentes loci o de un cromosoma a otro. El reposicionamiento de estos transposones (que codificaban el color) permitía la expresión de otros genes de pigmento. ^{[ 2 ]} La transposición en el maíz causa cambios de color; sin embargo, en otros organismos, como las bacterias, puede causar resistencia a los antibióticos . ^{[ 2 ]} La transposición también es importante para crear diversidad genética dentro de las especies y generar adaptabilidad a condiciones de vida cambiantes. ^{[ 3 ]}

Las transposasas se clasifican bajo el número EC 2.7.7. Los genes que codifican las transposasas están ampliamente distribuidos en los genomas de la mayoría de los organismos y son los genes más abundantes conocidos. ^{[ 4 ]} Durante el curso de la evolución humana, hasta el 40 % del genoma humano se ha desplazado mediante métodos como la transposición de transposones. ^{[ 2 ]}

La transposasa (Tnp) Tn5 pertenece a la superfamilia de proteínas RNasa , que incluye las integrasas retrovirales . Tn5 se encuentra en las bacterias Shewanella y Escherichia . ^{[ 5 ]} El transposón codifica la resistencia a la kanamicina y otros antibióticos aminoglucósidos. ^{[ 3 ] [ 6 ]}

Tn5 y otras transposasas son notablemente inactivas. Dado que los eventos de transposición de ADN son inherentemente mutagénicos, la baja actividad de las transposasas es necesaria para reducir el riesgo de causar una mutación fatal en el huésped y, por lo tanto, eliminar el elemento transponible . Una de las razones por las que Tn5 es tan poco reactiva es que los extremos N y C se encuentran relativamente cerca uno del otro y tienden a inhibirse mutuamente. Esto se dilucidó mediante la caracterización de varias mutaciones que dieron lugar a formas hiperactivas de transposasas. Una de estas mutaciones, L372P, es una mutación del aminoácido 372 en la transposasa Tn5. Este aminoácido es generalmente un residuo de leucina en el centro de una hélice alfa. Cuando esta leucina se reemplaza por un residuo de prolina, la hélice alfa se rompe, introduciendo un cambio conformacional en el dominio C-terminal, separándolo del dominio N-terminal lo suficiente como para promover una mayor actividad de la proteína. ^{[ 3 ]} La transposición de un transposón a menudo solo necesita tres piezas: el transposón, la enzima transposasa y el ADN diana para la inserción del transposón. ^{[ 3 ]} Este es el caso de Tn5, que utiliza un mecanismo de corte y pegado para mover transposones. ^{[ 3 ]}

Tn5 y la mayoría de las demás transposasas contienen un motivo DDE, que es el sitio activo que cataliza el movimiento del transposón. El sitio activo, una tríada de residuos ácidos, está compuesto por aspartato-97, aspartato-188 y glutamato-326. ^{[ 7 ]} Se dice que el motivo DDE coordina iones metálicos divalentes, principalmente magnesio y manganeso, que son importantes en la reacción catalítica. ^{[ 7 ]} Debido a que la transposasa es increíblemente inactiva, la región DDE se muta para que la transposasa se vuelva hiperactiva y catalice el movimiento del transposón. ^{[ 7 ]} El glutamato se transforma en un aspartato y los dos aspartatos en glutamatos. ^{[ 7 ]} Mediante esta mutación, se hace posible el estudio de Tn5, pero como resultado se pierden algunos pasos del proceso catalítico. ^{[ 3 ]}

Existen varios pasos que catalizan el movimiento del transposón, incluyendo la unión de Tnp, la sinapsis (la creación de un complejo sináptico), la escisión, la captura del objetivo y la transferencia de la hebra. La transposasa se une a la hebra de ADN y crea una pinza sobre el extremo del ADN que contiene el transposón, insertándose en el sitio activo. Una vez que la transposasa se une al transposón, produce un complejo sináptico en el que dos transposasas se unen en una relación cis/trans con el transposón. ^{[ 3 ]}

En la escisión, los iones de magnesio activan el oxígeno de las moléculas de agua y las exponen al ataque nucleofílico. ^{[ 6 ]} Esto permite que las moléculas de agua corten las hebras 3' en ambos extremos y creen una formación en horquilla, que separa el transposón del ADN donante. ^{[ 3 ]} A continuación, la transposasa mueve el transposón a una ubicación adecuada. No se sabe mucho sobre la captura del objetivo, aunque existe un sesgo de secuencia que aún no se ha determinado. ^{[ 3 ]} Después de la captura del objetivo, la transposasa ataca el ADN objetivo a nueve pares de bases de distancia, lo que resulta en la integración del transposón en el ADN objetivo. ^{[ 3 ]}

Como se mencionó anteriormente, debido a las mutaciones del DDE, se pierden algunos pasos del proceso; por ejemplo, cuando este experimento se realiza in vitro , el tratamiento térmico con SDS desnaturaliza la transposasa. Sin embargo, aún se desconoce qué sucede con la transposasa in vivo . ^{[ 3 ]}

El estudio de la transposasa Tn5 es de importancia general debido a sus similitudes con el VIH -1 y otras enfermedades retrovirales. Al estudiar Tn5, también se puede descubrir mucho sobre otras transposasas y sus actividades. ^{[ 3 ]}

Tn5 se utiliza en la secuenciación del genoma mediante el uso de Tn5 para agregar adaptadores de secuenciación y fragmentar el ADN en una sola reacción enzimática en 2010, ^{[ 8 ]} reduciendo el tiempo y los requisitos de entrada en comparación con la preparación tradicional de bibliotecas de secuenciación de próxima generación . La estrategia basada en Tn5 puede simplificar significativamente el protocolo de preparación de bibliotecas e incluso puede incorporarse a la PCR directa de colonias para un gran número de aislados bacterianos sin un sesgo de cobertura evidente. ^{[ 8 ]} Las principales desventajas son un menor control del tamaño de los fragmentos en comparación con la fragmentación enzimática y la fragmentación mecánica, y un sesgo hacia un alto contenido de GC. ^{[ 8 ]} Este método de preparación de bibliotecas también se utiliza en la técnica ATAC-seq .

La transposasa Sleeping Beauty (SB) es la recombinasa que impulsa el sistema de transposones Sleeping Beauty . ^{[ 9 ]} La transposasa SB pertenece a la familia de transposasas DD[E/D], que a su vez pertenece a una gran superfamilia de polinucleotidil transferasas que incluye la RNasa H, la resolvasa RuvC Holliday, las proteínas RAG y las integrasas retrovirales. ^{[ 10 ] [ 11 ]} El sistema SB se utiliza principalmente en animales vertebrados para la transferencia de genes, ^{[ 12 ]} incluyendo la terapia génica, ^{[ 13 ] [ 14 ]} y el descubrimiento de genes. ^{[ 15 ] [ 16 ]} La SB100X modificada genéticamente es una enzima que dirige los altos niveles de integración del transposón. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

El transposón Tn7 es un elemento genético móvil que se encuentra en muchos procariotas, como Escherichia coli ( E. coli ), y se descubrió por primera vez como una secuencia de ADN en cromosomas bacterianos y plásmidos naturales que codificaban resistencia a los antibióticos trimetoprima y estreptomicina . ^{[ 19 ] [ 20 ]} Clasificado específicamente como un elemento transponible (transposón), la secuencia puede duplicarse y moverse dentro de un genoma mediante una enzima recombinasa autocodificada llamada transposasa, lo que produce efectos como la creación o reversión de mutaciones y cambios en el tamaño del genoma. El transposón Tn7 ha desarrollado dos mecanismos para promover su propagación entre procariotas. ^{[ 21 ]} Al igual que muchos otros transposones bacterianos, Tn7 se transpone con baja frecuencia y se inserta en muchos sitios diferentes con poca o ninguna selectividad de sitio. A través de esta primera vía, Tn7 se dirige preferentemente a plásmidos conjugables , que pueden replicarse y distribuirse entre bacterias. Sin embargo, Tn7 es único porque también se transpone con alta frecuencia en un único sitio específico de los cromosomas bacterianos llamado attTn7. ^{[ 22 ]} Esta secuencia específica es un gen esencial y altamente conservado que se encuentra en muchas cepas de bacterias. No obstante, la recombinación no es perjudicial para la bacteria huésped, ya que Tn7 se transpone corriente abajo del gen tras reconocerlo, lo que resulta en una forma segura de propagar el transposón sin matar al huésped. Esta vía de selección del sitio objetivo, altamente evolucionada y sofisticada, sugiere que esta vía evolucionó para promover la coexistencia entre el transposón y su huésped, así como la transmisión exitosa de Tn7 a futuras generaciones de bacterias. ^{[ 21 ]}

El transposón Tn7 tiene una longitud de 14 kb y codifica cinco enzimas. ^{[ 21 ]} Los extremos de la secuencia de ADN constan de dos segmentos con los que interactúa la transposasa Tn7 durante la recombinación. El segmento izquierdo (Tn7-L) tiene una longitud de 150 pb y la secuencia derecha (Tn7-R) tiene una longitud de 90 pb. Ambos extremos del transposón contienen una serie de sitios de unión de 22 pb que la transposasa Tn7 reconoce y a los que se une. Dentro del transposón hay cinco genes discretos que codifican proteínas que conforman la maquinaria de transposición. Además, el transposón contiene un integrón , un segmento de ADN que contiene varias casetes de genes que codifican la resistencia a los antibióticos. ^{[ 21 ]}

El transposón Tn7 codifica cinco proteínas: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD y TnsE. ^{[ 21 ]} TnsA y TnsB interactúan para formar la enzima transposasa TnsAB. Esta enzima reconoce y se une específicamente a los extremos de la secuencia de ADN del transposón, y la escinde introduciendo rupturas de ADN de doble cadena en cada extremo. La secuencia escindida se inserta entonces en otro sitio de ADN diana. Al igual que otros transposones caracterizados, el mecanismo de transposición de Tn7 implica la escisión de los extremos 3' del ADN donante por la proteína TnsA de la transposasa TnsAB. Sin embargo, Tn7 también se escinde de forma única cerca de los extremos 5', aproximadamente a 5 pb del extremo 5' hacia el transposón Tn7, por la proteína TnsB de TnsAB. Tras la inserción del transposón en el sitio diana del ADN, los extremos 3' se unen covalentemente al ADN diana, pero persisten huecos de 5 pb en los extremos 5'. Como resultado, la reparación de estos huecos produce una duplicación adicional de 5 pb en el sitio diana. La proteína TnsC interactúa con la enzima transposasa y el ADN diana para promover los procesos de escisión e inserción. La capacidad de TnsC para activar la transposasa depende de su interacción con el ADN diana junto con su proteína diana correspondiente, TnsD o TnsE. Las proteínas TnsD y TnsE son selectores diana alternativos que también actúan como activadores de unión al ADN , promoviendo la escisión e inserción de Tn7. Su capacidad para interactuar con un ADN diana específico es clave para la selección del sitio diana de Tn7. Las proteínas TnsA, TnsB y TnsC forman así la maquinaria central de Tn7: TnsA y TnsB interactúan para formar la transposasa, mientras que TnsC actúa como regulador de su actividad, comunicándose entre la transposasa y TnsD y TnsE. Cuando la proteína TnsE interactúa con la maquinaria central TnsABC, Tn7 dirige preferentemente las inserciones en plásmidos conjugables. Cuando la proteína TnsD interactúa con TnsABC, Tn7 dirige preferentemente las inserciones aguas abajo hacia un único sitio esencial y altamente conservado en el cromosoma bacteriano. Este sitio, attTn7, es reconocido específicamente por TnsD. ^{[ 21 ]}

• Transposasas en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q46731 (Transposasa para el transposón Tn5) en el PDBe-KB .