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Los transposones como herramienta genética

Los transposones son secuencias de ADN semiparasitarias que pueden replicarse y propagarse por el genoma del huésped . Pueden utilizarse como herramienta genética para el anális...

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Los transposones son secuencias de ADN semiparasitarias que pueden replicarse y propagarse por el genoma del huésped . Pueden utilizarse como herramienta genética para el análisis de la función de genes y proteínas . El uso de transposones está muy extendido en Drosophila (donde los elementos P son los más utilizados), en Arabidopsis thaliana y en bacterias como Escherichia coli ( E. coli ). [ 1 ] [ 2 ] 

Actualmente, los transposones se utilizan en la investigación genética y la ingeniería genética recombinante para la mutagénesis por inserción . La mutagénesis por inserción consiste en que los transposones actúan como vectores para eliminar e integrar secuencias genéticas. Gracias a su diseño relativamente sencillo y su capacidad inherente para transportar secuencias de ADN, los transposones son altamente compatibles con la transducción de material genético, lo que los convierte en herramientas genéticas ideales.

Mutagénesis por marcaje de firmas

La mutagénesis por marcaje de firmas (también conocida como STM) es una técnica que se centra en el uso de la inserción de elementos transponibles para determinar el fenotipo de un locus en el genoma de un organismo. Si bien las técnicas de secuenciación genética pueden determinar el genotipo de un genoma, no pueden determinar la función o la expresión fenotípica de las secuencias genéticas. [ 3 ] [ 4 ] La STM puede sortear este problema mutando un locus, lo que provoca que forme un nuevo fenotipo; al comparar las expresiones fenotípicas observadas del locus mutado y el no alterado, se puede deducir la expresión fenotípica del locus.

En la STM, se insertan transposones marcados específicamente en un organismo, como una bacteria, y se integran aleatoriamente en el genoma del huésped. En teoría, el organismo mutante modificado debería expresar el gen alterado, modificando así el fenotipo. Si se observa un nuevo fenotipo, se secuencia el genoma y se buscan los transposones marcados. [ 3 ] Si se encuentra el sitio de integración del transposón, entonces el locus podría ser responsable de la expresión de los fenotipos. [ 5 ] [ 6 ]

Se han realizado numerosos estudios sobre STM basados ​​en transposones, especialmente con los elementos P [ 4 ] en Drosophila . Los elementos P son transposones descritos originalmente en el genoma de Drosophila melanogaster, capaces de ser sintetizados artificialmente o propagados a otras especies de Drosophila mediante transferencia horizontal. [ 4 ] En ensayos experimentales, se insertan elementos P y genes de transposasa creados artificialmente en los genomas de embriones de Drosophila . Posteriormente, se secuencian y comparan los genomas de los embriones que presentan mutaciones, revelando así los loci afectados por la inserción y sus funciones. [ 4 ] [ 6 ]

Inactivación por inserción

La inactivación por inserción se centra en suprimir la expresión de un gen interrumpiendo su secuencia mediante una inserción. Cuando se insertan nucleótidos adicionales cerca o dentro de un locus, este puede sufrir una mutación por cambio de marco de lectura que podría impedir su correcta expresión en una cadena polipeptídica . La inactivación por inserción basada en transposones se considera para la investigación médica, desde la supresión de la resistencia a los antibióticos en bacterias hasta el tratamiento de enfermedades genéticas . [ 7 ] En el tratamiento de enfermedades genéticas, la inserción de un transposón en el locus de un gen dañino del genoma del organismo desalinearía la secuencia del locus, truncando cualquier proteína dañina formada y dejándola no funcional. Alternativamente, la inactivación por inserción podría usarse para suprimir genes que expresan resistencia a los antibióticos en bacterias. [ 7 ] [ 8 ]

la Bella durmiente del bosque

Si bien los transposones se han utilizado con éxito en plantas e invertebrados mediante mutagénesis por inserción y activación por inserción, su uso en vertebrados se ha visto limitado por la falta de transposones específicos para estos. Casi todos los transposones compatibles con los genomas de vertebrados y presentes en ellos están inactivos y a menudo se consideran ADN basura. [ 6 ] Sin embargo, es posible identificar transposones latentes y recrearlos artificialmente como agentes activos. [ 6 ] Los investigadores genéticos Zsuzsanna Izsvák y Zoltán Ivics descubrieron una secuencia de transposón de pez que, a pesar de haber permanecido latente durante 15 millones de años, podía reactivarse como vector para introducir genes extraños en los genomas de vertebrados, incluidos los humanos. Este transposón, denominado Sleeping Beauty , fue descrito en 1997 y pudo reactivarse artificialmente para convertirse en un transposón funcional. [ 6 ]

Sleeping Beauty también puede ser viable en procedimientos de terapia génica al ayudar a introducir transgenes beneficiosos en los genomas del huésped. Belcher et al. probaron esta idea utilizando transposones de Sleeping Beauty para insertar secuencias en ratones con anemia falciforme, de modo que pudieran producir las enzimas necesarias para contrarrestar su anemia. [ 6 ] Belcher et al. comenzaron su experimento construyendo una secuencia genética que consistía en el elemento transponible Hmox-1 y la transposasa de Sleeping Beauty. Esta secuencia se insertó en un plásmido y se introdujo en las células de los ratones. La transposasa de Sleeping Beauty ayudó a insertar el transposón Hmox-1 en el genoma de los ratones, permitiendo la producción de la enzima hemooxigenasa -1 (HO-1). Los ratones que recibieron la inserción mostraron un aumento de cinco veces en la expresión de HO-1, lo que a su vez redujo la obstrucción de los vasos sanguíneos causada por la anemia falciforme. La publicación del experimento en 2010 demostró que los transposones pueden ser útiles en la terapia génica. [ 6 ]

Elementos P como herramienta ( Drosophila )

Los elementos P presentes de forma natural contienen:

  • secuencia codificante para la enzima transposasa ;
  • Secuencias de reconocimiento para la acción de la transposasa.

La transposasa es una enzima que regula y cataliza la escisión de un elemento P del ADN huésped, cortando en dos sitios de reconocimiento, para luego reinsertar el elemento P aleatoriamente. Este proceso de inserción aleatoria, que puede interferir con genes existentes o introducir un gen adicional, se utiliza en la investigación genética.

Para utilizar este proceso como una herramienta genética útil y controlable, las dos partes del elemento P deben estar separadas para evitar la transposición incontrolada. Por lo tanto, las herramientas genéticas habituales son:

  • ADN que codifica la transposasa (o en ocasiones simplemente transposasa) sin secuencias de reconocimiento de transposasa, por lo que no puede insertarse; y
  • un "Plásmido P".

Los plásmidos P siempre contienen:

  • un gen reportero de Drosophila , a menudo un marcador de ojos rojos (el producto del gen blanco );
  • secuencias de reconocimiento de la transposasa;

y puede contener:

Métodos de uso ( Drosophila )

( Métodos de genética directa ) Hay dos formas principales de utilizar estas herramientas: la transformación de moscas y la mutagénesis por inserción, cada una de las cuales se describe a continuación.

Transformación de mosca

(con la esperanza de insertarlo en regiones no codificantes)

  1. Microinyectar en el extremo posterior de un embrión en etapa temprana (precelularización) el código para la transposasa y un plásmido con el gen reportero, el gen de interés y las secuencias de reconocimiento de la transposasa.
  2. Se produce una transposición aleatoria, insertando el gen de interés y el gen reportero.
  3. Cría moscas y crúzalas para eliminar la variación genética entre las células del organismo. (Solo algunas de las células del organismo se habrán transformado. Al cruzarlas, solo se transmite el genotipo de los gametos, eliminando así esta variación).
  4. Busque moscas que expresen el gen reportero. Estas portan el gen de interés insertado, por lo que pueden ser investigadas para determinar el fenotipo debido a dicho gen.

Es importante tener en cuenta que el gen insertado podría haber dañado la función de alguno de los genes del huésped. Se requieren varias líneas de moscas para poder realizar comparaciones y asegurar que no se hayan inactivado genes adicionales.

Mutagénesis por inserción

(con la esperanza de insertarlo en la región codificante)

  1. Microinyectar en el embrión el código genético para la transposasa y un plásmido con el gen reportero y las secuencias de reconocimiento de la transposasa (y a menudo el gen reportero de E. coli y el origen de replicación, etc.).
  2. La transposición aleatoria consiste en la inserción aleatoria del gen reportero. Esta inserción tiende a ocurrir cerca de genes que se transcriben activamente, ya que es allí donde la estructura de la cromatina es más laxa y, por lo tanto, el ADN es más accesible.
  3. Cultivar moscas y cruzarlas para eliminar la variación genética entre las células del organismo (véase más arriba).
  4. Busque moscas que expresen el gen reportero. Estas han experimentado una transposición exitosa, por lo que pueden investigarse para determinar el fenotipo debido a la mutación de genes existentes.

Posibles mutaciones:

  1. Inserción en una región traducida => proteína híbrida/proteína truncada. Generalmente causa pérdida de la función proteica, aunque se observan efectos más complejos.
  2. La inserción en un intrón provoca una alteración en el patrón de empalme o un fallo en el mismo. Generalmente, esto resulta en la truncación de la proteína o en la producción de productos de empalme incorrectos inactivos, aunque son comunes efectos más complejos.
  3. La inserción en la región no traducida 5' (la secuencia que se convertirá en la región 5' UTR del ARNm) provoca el truncamiento del transcrito. Esto suele resultar en que el ARNm no contenga una caperuza 5' , lo que conlleva una traducción menos eficiente.
  4. Inserción en el promotor => reducción/pérdida total de la expresión. Siempre resulta en niveles de producción de proteína muy reducidos. Es el tipo de inserción más útil para el análisis debido a la simplicidad de la situación.
  5. Inserción entre el promotor y los potenciadores corriente arriba => pérdida de la función del potenciador/apropiación indebida de la función del potenciador para el gen reportero.† Generalmente reduce el nivel de especificidad de la proteína para el tipo de célula, aunque a menudo se observan efectos complejos.
† Atrapamiento de potenciadores

El secuestro de un potenciador de otro gen permite analizar la función de dicho potenciador. Esto, especialmente si el gen reportero codifica una proteína fluorescente, puede utilizarse para mapear la expresión del gen mutado en el organismo, y constituye una herramienta muy potente.

Otros usos de los elementos P ( Drosophila )

(Método de genética inversa)

Movilización secundaria

Si existe un elemento P antiguo cerca del gen de interés (con una transposasa defectuosa), se puede reactivar mediante la microinyección del embrión con el gen que codifica la transposasa o con la propia transposasa. El elemento P suele transponerse a pocos kilobases de su ubicación original, afectando así al gen de interés, como en el caso de la mutagénesis por inserción.

Análisis de productos de mutagénesis ( Drosophila )

Una vez determinada la función de la proteína mutada, es posible secuenciar/purificar/clonar las regiones que flanquean la inserción mediante los siguientes métodos:

PCR inversa

Proceso de análisis del ADN que flanquea una inserción conocida mediante PCR.
  1. Aislar el genoma de la mosca.
  2. Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] que se sabe que NO corta en el gen reportero), dando fragmentos de unos pocos kilobases, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
  3. Autoliga el fragmento digerido (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando como resultado una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
  4. Cortar los plásmidos en algún punto del gen reportero (con una enzima [enzima 2] que se sabe que corta muy raramente en el ADN genómico, pero que se sabe que lo hace en el gen reportero).
  5. Utilizando cebadores para las secciones del gen reportero, el ADN puede amplificarse para su secuenciación .

El proceso de corte, autoligación y nuevo corte permite la amplificación de las regiones flanqueantes del ADN sin conocer la secuencia. El punto donde se produjo la ligación se puede observar identificando el sitio de corte de la enzima 1.

Rescate de plásmidos ( transformación de E. coli )

Proceso de análisis del ADN que flanquea un inserto conocido mediante rescate de plásmidos.
  1. Aislar el genoma de la mosca.
  2. Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] conocida por cortar en el límite entre el gen reportero y las secuencias del gen reportero y del plásmido de E. coli ), dando fragmentos de unos pocos kilobases, algunos con el gen reportero de E. coli , las secuencias del plásmido y su ADN flanqueante.
  3. Autoligar el extracto digerido (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando como resultado una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con el reportero de E. coli , las secuencias del plásmido y su ADN flanqueante.
  4. Insertar los plásmidos en células de E. coli (por ejemplo, mediante electroporación).
  5. Analizar los plásmidos para detectar el gen reportero de E. coli. Solo los plásmidos insertados correctamente que contengan las secuencias de mantenimiento celular expresarán este gen.

7. El gen puede clonarse para su posterior análisis.

Aplicación de elementos transponibles en otros organismos

Los genomas de otros organismos pueden analizarse de forma similar, aunque con diferentes elementos transponibles. El reciente descubrimiento del transposón mariner (a partir de la reconstrucción de la secuencia original de numerosas versiones inactivas en el genoma humano) ha permitido realizar muchos experimentos nuevos. Mariner posee homólogos bien conservados en una amplia gama de especies y es una herramienta muy versátil.

Referencias

Este artículo incorpora material del artículo de Citizendium " Transposones como herramienta genética ", que está bajo la licencia Creative Commons Attribution-ShareAlike 3.0 Unported , pero no bajo la GFDL .

  1. ↑ Beckwith, J.; Silhavy, TJ (1992). El poder de la genética bacteriana: un curso basado en la literatura . Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. págs. 555–614 . ISBN  0-87969-411-4.
  2. ↑ Kleckner N, Roth J, Botstein D (octubre de 1977). "Ingeniería genética in vivo mediante elementos de resistencia a fármacos translocables. Nuevos métodos en genética bacteriana". J. Mol. Biol . 116 (1): 125– 59. doi : 10.1016/0022-2836(77)90123-1 . PMID 338917 . 
  3. 1 2 Berg, Claire; Berg, Douglass E. "Herramientas de elementos transponibles para la genética microbiana" . EcoSal.
  4. 1 2 3 4 Engels, William R. "Elementos P en Drosophila" . Departamento de Genética, Universidad de Wisconsin. Archivado del original el 11 de enero de 2006.
  5. ↑ Ivics Z, Li MA, Mátés L, et al. (junio de 2009). "Manipulación del genoma mediada por transposones en vertebrados" . Nat . Methods . 6 (6): 415–22 . doi : 10.1038/nmeth.1332 . PMC 2867038. PMID 19478801 .   
  6. 1 2 3 4 5 6 7 Luft FC (julio de 2010). "La Bella Durmiente alcanza nuevas alturas" . J. Mol. Med . 88 (7): 641–3 . doi : 10.1007/s00109-010-0626-1 . PMID 20467721 . 
  7. 1 2 Berger-Bächi B (abril de 1983). "Inactivación por inserción de la resistencia a la meticilina estafilocócica por Tn551" . J. Bacteriol . 154 (1): 479–87 . PMC 217482. PMID 6300037 .  
  8. ↑ Zoltaná Ivics; Meng Amy Li; Lajos Mates; Jef D. Boeke; Allan Bradley (junio de 2009). "Manipulaciones del genoma mediadas por transposones en vertebrados" . Nat . Methods . 6 (6): 415–22 . doi : 10.1038/nmeth.1332 . PMC 2867038. PMID 19478801 .  

Lecturas adicionales

  • Snyder, L.; Champness, W. (2003). «Cap. 9: Transposición y recombinación sitio-específica». Genética molecular de bacterias (2.ª  ed.). Washington D. C.: ASM Press. págs. 303-340 . ISBN  1-55581-204-X.
  • "Bibliografía: Los transposones como herramienta genética" . Citizendium.org.
  • Martienssen, RA; Springer, PS "Mutagénesis por transposones de trampa génica y potenciadores en Arabidopsis" . Laboratorio Cold Spring Harbor.
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