Cristalización del virus

Los cristales virales tienen su origen a finales del siglo XIX, cuando los biólogos alemanes Ritthausen y Osborne realizaron los primeros descubrimientos sobre la cristalización de proteínas , principalmente de la hemoglobina en gusanos y peces . ^{[ 3 ]} Estas primeras observaciones se consideraron inicialmente como meras curiosidades de laboratorio. Lo que comenzó como simples curiosidades evolucionó hasta convertirse en la necesidad de purificar y aislar proteínas para una visualización más clara, lo que condujo a la cristalización de proteínas . Las técnicas de cristalización de proteínas se introdujeron finalmente en la virología tras la aparición de los virus del mosaico del tabaco (TMV) , los primeros virus descubiertos. ^{[ 4 ]}

Lograr una visualización clara de los virus utilizando tecnología limitada, como la microscopía, era difícil debido a su tamaño relativamente minúsculo, ya que los virus más pequeños medían aproximadamente 20  nm de diámetro. ^{[ 5 ]} Por lo tanto, la microscopía era un campo relativamente desafiante, con una gran demanda de métodos de observación alternativos. Los virus TMV fueron cristalizados por primera vez por Wendell Stanley , quien demostró que los virus TMV conservaban su infectividad incluso en forma cristalina. ^{[ 3 ]} Fue durante este tiempo cuando los investigadores descubrieron que los virus cristalizados (al igual que las proteínas y otras moléculas orgánicas) podían difractar los rayos X, lo que implicaba un mecanismo estructural complejo en los cuerpos virales. Este avance sirvió como base para la expansión de la virología hacia la cristalografía de rayos X. ^{[ 3 ]}

La cristalografía de rayos X se desarrolló a mediados del siglo XX gracias a los esfuerzos de los científicos por estudiar las características de los virus cristalizados en investigaciones de laboratorio. Entre ellos se encontraba Dorothy Hodgkin , experta en microbiología molecular, quien determinó la estructura del TMV mediante cristales virales que podían difractar rayos X. ^{[ 7 ]} Este descubrimiento sirvió de base para el perfeccionamiento continuo de los métodos de cristalografía viral, lo que posteriormente condujo a la determinación de numerosas estructuras virales , incluyendo el poliovirus , el rinovirus y el retrovirus humano (VIH) . Estos avances proporcionaron información valiosa sobre los mecanismos de infección y replicación viral , facilitando así el desarrollo de fármacos antivirales y vacunas a finales del siglo XX.

Hacia finales del siglo XX, los científicos se percataron de que los virus rodeados de gruesas membranas lipídicas eran incapaces de formar cristales ordenados. ^{[ 3 ]} Estos virus dificultaban la obtención de resultados adecuados mediante difracción de rayos X. ^{[ 3 ]} En respuesta a esto, la microscopía electrónica criogénica (crio-EM) surgió como un nuevo método alternativo para estudiar las estructuras virales . La crio-EM permite a los científicos visualizar virus con una resolución casi atómica sin necesidad de cristalización . ^{[ 3 ]} La combinación de la cristalografía de rayos X y la crio-EM ha contribuido al campo de la morfología y el comportamiento de los virus en el sistema inmunitario . Estos avances tecnológicos no solo han esclarecido las características virales, sino que han revolucionado la virología en su conjunto y siguen siendo objeto de gran interés hasta el día de hoy.

La estructura helicoidal de la cápside depende principalmente de la longitud del genoma de ARN o ADN viral . ^{[ 11 ]} Debido a la naturaleza del empaquetamiento de proteínas asimétricas idénticas sin simetría rotacional para minimizar la perturbación de los enlaces proteína-proteína en sitios de unión y receptores específicos, las estructuras de la proteína de la cápside compuestas por una repetición de subunidades proteicas idénticas se organizan necesariamente en una red que se pliega para encerrar su contenido en una estructura helicoidal, muy similar a la estructura helicoidal que se observa naturalmente en el ADN . ^{[ 11 ]} Esta estructura helicoidal resultante se debe a las limitaciones geométricas y la naturaleza simétrica requeridas por la disposición de subensamblajes proteicos y sus interacciones proteína-proteína. ^{[ 11 ]} El virus del mosaico del tabaco estudiado por Caspar y Klug en su estudio de cristalización de 1962 se descubrió que estaba compuesto por un "agregado de 2 a 5 subunidades de proteína de la cápside", dispuestas en una estructura de cápside helicoidal. ^{[ 11 ]}

La estructura de la cápside icosaédrica depende principalmente de la eficiencia energética y las limitaciones geométricas del empaquetamiento del genoma. ^{[ 11 ]} De manera similar a las restricciones que dan lugar a la naturaleza simétrica de la estructura de la cápside helicoidal , ciertas limitaciones geométricas se aplican de forma natural y necesaria a las posibles conformaciones de la estructura de envoltura. La estructura de la cápside icosaédrica es la disposición más común debido a la simetría 2-3-5 de su forma homónima, lo que permite el uso de hasta el mayor número (60 unidades) de "unidades simétricas idénticas" triangulares para construir una cubierta "esférica" ​​que encierre un material dado de cualquier tamaño. ^{[ 12 ]} En términos de optimización de la relación entre el número de subconjuntos de proteínas requeridos y el área de superficie encerrada, la simetría icosaédrica se encuentra nuevamente como la simetría más pequeña y eficiente para adoptar. ^{[ 11 ]} La estructura de la cápside icosaédrica es un diseño óptimo para encapsular material debido a sus propiedades geométricas y simétricas, lo que hace que su diseño eficiente sea adoptado de forma natural y necesaria por la mayoría de los linajes virales. ^{[ 11 ]} La naturaleza simétrica y altamente ordenada de la mayoría de los cristales virales puede atribuirse a la simetría inherente de la estructura de la cápside icosaédrica y sus interacciones proteína-proteína. ^{[ 1 ]}

Los virus generalmente invaden y secuestran las células huésped como método de replicación. ^{[ 13 ]} Una vez infectada, la célula huésped ve comprometidos sus procesos celulares , ya que se producen proteínas codificadas por el virus a partir de la replicación y propagación viral. ^{[ 13 ]} Este proceso consiste en interacciones proteína-proteína de la estructura primaria y terciaria de la cápside , y es objeto de gran atención para una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y bioquímicos del comportamiento viral. ^{[ 1 ]}

La cristalografía de rayos X utiliza la capacidad de los cristales virales para difractar ondas electromagnéticas al ser expuestos. ^{[ 21 ]} La difracción en este caso se refiere a la interferencia de ondas dispersas emitidas en diferentes direcciones a través de la red. ^{[ 21 ]} Los patrones de difracción dependen del orden interno dentro del cristal. ^{[ 3 ]} Un alto orden interno con disposiciones densas produce patrones de difracción más extensos con mayor resolución, lo que permite una determinación más precisa de las posiciones atómicas. ^{[ 3 ]} Se utiliza un difractómetro de rayos X para medir la capacidad del cristal para difractar ondas al ser expuesto a la fuente de rayos X. ^{[ 21 ]}

La cristalografía de rayos X no garantiza un rendimiento preciso para todos los cristales virales. Por ejemplo, los cristales virales de tamaño macromolecular presentan limitaciones significativas en comparación con los cristales más pequeños. ^{[ 3 ]} Son más blandos y susceptibles a sufrir daños, y pueden desintegrarse fácilmente bajo alta radiación. ^{[ 3 ]} Esto se debe a la cantidad significativa de líquido entre las moléculas, con un contenido de disolvente de aproximadamente el 50% en promedio. ^{[ 3 ]} El disolvente está compuesto por agua y otras moléculas pequeñas que se difunden libremente a través de los espacios intersticiales del cristal. ^{[ 3 ]} Esta presencia indeseada de canales llenos de disolvente dentro de los cristales macromoleculares dificulta la lectura de los patrones de difracción de rayos X. ^{[ 3 ]}

La microscopía electrónica criogénica (Cryo-EM) utiliza la cinética de un haz de electrones para detectar y obtener imágenes de una muestra. ^{[ 22 ]} La Cryo-EM ofrece un rendimiento superior al del microscopio óptico tradicional debido a su mayor resolución y aumento. ^{[ 22 ]}

En la criomicroscopía electrónica, la cristalización no es necesaria y permite observar directamente muestras biológicas, como células huésped infectadas y virus activos. ^{[ 17 ]} Esto ofrece ventajas significativas sobre la cristalografía de rayos X al investigar estructuras virales complejas que presentan dificultades durante la cristalización. Resulta particularmente útil para observar los cambios conformacionales del virus, algo difícil de lograr mediante la cristalización. ^{[ 17 ]}

Sin embargo, a pesar de que la crio-EM puede proporcionar una resolución mayor que los microscopios ópticos , no es suficiente para superar la de la cristalografía de rayos X. ^{[ 17 ]} La cristalografía de rayos X sigue siendo el método más adecuado cuando se tienen en cuenta las estructuras a nivel atómico y las interacciones micromoleculares. ^{[ 17 ]} Por lo tanto, los investigadores combinan la crio-EM y la cristalización de rayos X como método para superar las limitaciones de cada una.

Los recientes avances en la criomicroscopía electrónica (crio-EM) han ampliado el alcance con el que los investigadores pueden descubrir la morfología de los virus. La crio-EM comenzó a incorporar detectores de electrones directos (DED) , que implican la conversión directa de los electrones emitidos en señales eléctricas, mejorando así la velocidad y la viabilidad del procedimiento de obtención de imágenes. ^{[ 23 ]} Las limitaciones en el estudio de grandes complejos moleculares se superaron con la introducción de la criotomografía electrónica (crio-ET) . Esta es una alternativa a la crio-EM que permite visualizar el entorno y la interacción fuera de la célula huésped habitada por el virus. ^{[ 23 ]} Estos avances han impulsado la comprensión de la actividad del virus en su entorno celular huésped, en lugar de centrarse únicamente en el virus en sí. ^{[ 23 ]}

Los avances en la cristalografía de rayos X, bajo el nombre de cristalografía macromolecular (MX), también han contribuido a la renovación de la tecnología de imagen. ^{[ 18 ]} La MX se considera una nueva disciplina científica que adapta herramientas avanzadas y procedimientos automatizados. Esto se lleva a cabo con fuentes de sincrotrón , detectores rápidos y métodos innovadores de suministro de muestras para estudiar las características dinámicas de las macromoléculas. ^{[ 18 ]} Esta técnica, que observa la dinámica de los virus en lugar de su composición estática, se denomina cristalografía resuelta en el tiempo . ^{[ 18 ]}

La cristalografía resuelta en el tiempo se facilita mediante láseres de electrones libres de rayos X (XFEL) , una nueva generación de fuentes de luz que sucede a la noción tradicional de radiación sincrotrón , ya que permite un mayor control sobre la potencia y el alcance de la luz. ^{[ 18 ] [ 24 ]} A pesar de la rápida evolución de la crio-EM, que no requiere cristalización, MX y XFEL permiten que la cristalización de virus siga siendo relevante y continúe desempeñando un papel vital al proporcionar detalles a nivel atómico de los virus. ^{[ 18 ]}