Secuencia reguladora

La expresión de genes en mamíferos puede incrementarse cuando se transmiten señales a los promotores asociados a dichos genes. Las secuencias de ADN cis -reguladoras , ubicadas en regiones de ADN alejadas de los promotores, pueden tener un gran impacto en la expresión génica, llegando algunos genes a experimentar un aumento de hasta 100 veces debido a estas secuencias . ^{[ 3 ]} Estas secuencias cis -reguladoras incluyen potenciadores , silenciadores , aisladores y elementos de anclaje. ^{[ 4 ]} Entre este conjunto de secuencias, los potenciadores y sus proteínas factor de transcripción asociadas desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. ^{[ 5 ]}

Los potenciadores son secuencias del genoma que constituyen elementos reguladores génicos clave. Controlan programas de expresión génica específicos de cada tipo celular, generalmente mediante bucles que recorren grandes distancias para acercarse físicamente a los promotores de sus genes diana. ^{[ 6 ]} En un estudio de neuronas de la corteza cerebral, se encontraron 24 937 bucles que acercaban potenciadores a los promotores. ^{[ 3 ]} Múltiples potenciadores, cada uno a menudo a decenas o cientos de miles de nucleótidos de distancia de sus genes diana, forman bucles hacia los promotores de estos genes y se coordinan entre sí para controlar la expresión de su gen diana común. ^{[ 6 ]}

La ilustración esquemática de esta sección muestra un potenciador que se enrolla para acercarse físicamente al promotor de un gen diana. El bucle se estabiliza mediante un dímero de una proteína conectora (por ejemplo, un dímero de CTCF o YY1 ), con un miembro del dímero anclado a su motivo de unión en el potenciador y el otro miembro anclado a su motivo de unión en el promotor (representado por los zigzags rojos en la ilustración). ^{[ 7 ]} Varias proteínas de factores de transcripción específicas de la función celular (en 2018 Lambert et al. indicaron que había alrededor de 1600 factores de transcripción en una célula humana ^{[ 8 ]} ) generalmente se unen a motivos específicos en un potenciador ^{[ 9 ]} y una pequeña combinación de estos factores de transcripción unidos al potenciador, cuando se acercan a un promotor mediante un bucle de ADN, regulan el nivel de transcripción del gen diana. El mediador (coactivador) (un complejo que generalmente consta de unas 26 proteínas en una estructura interactiva) comunica señales reguladoras de los factores de transcripción unidos al ADN potenciador directamente a la enzima ARN polimerasa II (RNAP II) unida al promotor. ^{[ 10 ]}

Los potenciadores, cuando están activos, generalmente se transcriben a partir de ambas hebras de ADN con ARN polimerasas que actúan en dos direcciones diferentes, produciendo dos eRNA como se ilustra en la figura. ^{[ 11 ]} Un potenciador inactivo puede estar unido a un factor de transcripción inactivo. La fosforilación del factor de transcripción puede activarlo y ese factor de transcripción activado puede luego activar el potenciador al que está unido (ver la pequeña estrella roja que representa la fosforilación de un factor de transcripción unido a un potenciador en la ilustración). ^{[ 12 ]} Un potenciador activado comienza la transcripción de su ARN antes de activar un promotor para iniciar la transcripción del ARN mensajero de su gen diana. ^{[ 13 ]}

Los sitios de unión de factores de transcripción dentro de los potenciadores (véase la figura anterior) suelen tener una longitud de aproximadamente 10 pares de bases, aunque pueden variar desde unos pocos hasta unos 20 pares de bases. ^{[ 14 ]} Los potenciadores suelen tener unos 10 sitios de unión de factores de transcripción dentro de un sitio potenciador promedio de unos 204 pares de bases. ^{[ 15 ]} Al examinar las interacciones reguladoras entre potenciadores y genes que ocurren en 352 tipos de células y tejidos, se encontraron más de 13 millones de potenciadores activos. ^{[ 16 ]}

Súper potenciador

Si bien los potenciadores son necesarios para la transcripción de genes en una célula por encima de niveles bajos, un grupo de potenciadores, conocido como superpotenciador, puede provocar la transcripción de un gen diana a niveles aún más altos. Los superpotenciadores suelen impulsar la expresión de genes necesarios para la identidad celular a niveles elevados. ^{[ 17 ] [ 18 ]} En el cáncer, un superpotenciador también puede impulsar la expresión de un oncogén específico a un nivel elevado. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

Un superpotenciador se define como un grupo de potenciadores típicos muy próximos en el genoma (a una distancia de entre 9000 ^{[ 17 ]} y 220000 ^{[ 19 ]} pares de bases) que, en conjunto, regulan la expresión de un gen diana. ^{[ 20 ]} Los genes controlados por superpotenciadores se expresan a niveles significativamente más altos que los genes controlados por potenciadores típicos. ^{[ 20 ]}

En la figura de esta sección se muestra un diagrama de un superpotenciador. En esta figura, el superpotenciador tiene 12 000 nucleótidos de longitud y contiene cuatro potenciadores típicos. Cada potenciador típico contacta simultáneamente con la región promotora del mismo gen diana. Cada potenciador típico dentro del superpotenciador posee múltiples motivos de ADN a los que se unen factores de transcripción. Cada potenciador típico también está unido a un complejo mediador de 26 componentes que transmite las señales de los factores de transcripción unidos al potenciador al promotor de su gen diana común. La proteína BRD4 forma un complejo con cada potenciador típico en el superpotenciador y ayuda a estabilizar su estructura. ^{[ 21 ]} Además, la proteína arquitectónica YY1 (indicada por pares de zigzags rojos) ayuda a mantener unidos los bucles que conectan los potenciadores típicos con su gen diana en el superpotenciador. ^{[ 7 ]} Por lo tanto, existen muchas proteínas estrechamente asociadas en un superpotenciador. Estas proteínas generalmente poseen un dominio estructurado y una cola con una región intrínsecamente desordenada (IDR). ^{[ 22 ]} Muchas de las IDR de estas proteínas interactúan entre sí, formando así un gel que excluye el agua o un condensado con separación de fases alrededor del superpotenciador. ^{[ 22 ]}

Algunos superpotenciadores inducen niveles de transcripción muy altos, como el superpotenciador de α-globina del ratón ^{[ 23 ]} y el superpotenciador Wap ^{[ 24 ]} . El superpotenciador de α-globina del ratón contiene cinco potenciadores típicos. Solo cuando actúan conjuntamente, aumentan la transcripción del gen de α-globina 450 veces ^{[ 23 ]} . En otro ejemplo, el superpotenciador Wap del ratón incluye tres potenciadores típicos. Solo cuando estos tres potenciadores actúan conjuntamente, aumentan la transcripción del gen Wap 1000 veces ^{[ 24 ] .}

Los potenciadores dentro de los superpotenciadores descritos anteriormente actúan de forma sinérgica. Sin embargo, en un segundo tipo de superpotenciador, los potenciadores componentes actúan de forma aditiva. En un tercer grupo, los superpotenciadores parecen actuar de forma "logística" cuando la actividad del promotor alcanza un límite. Un estudio examinó 773 genes diana que se emparejaron con grupos cercanos de posibles superpotenciadores (con entre 2 y 20 potenciadores en proximidad que probablemente actúan como superpotenciadores). En este estudio, se observó que 277, 92 y 250 de los probables superpotenciadores actuaban según los modelos aditivo, sinérgico y logístico, respectivamente. ^{[ 25 ]}

Los superpotenciadores pueden ocupar regiones del genoma de entre 10 000 y 60 000 nucleótidos de longitud. ^{[ 26 ]} mientras que los potenciadores típicos tienen aproximadamente 204 pares de bases de longitud. ^{[ 15 ]} Al evaluar ocho tipos de células, los superpotenciadores constituyeron entre el 2,5 % y el 10,9 % de los potenciadores que impulsan la transcripción, mientras que los potenciadores típicos fueron la mayoría de los potenciadores que impulsan la transcripción. Hubo entre 257 y 1099 superpotenciadores en estos ocho tipos de células y entre 5512 y 23 869 potenciadores típicos. ^{[ 27 ]}

Si bien los superpotenciadores solo están activos en aproximadamente el 2,5 % al 10,9 % de los sitios de transcripción activa en una célula, reclutan la maquinaria de transcripción de forma más activa que los potenciadores simples típicos. Los superpotenciadores en una célula utilizan aproximadamente del 12 % al 36 % de las ARN polimerasas, las proteínas mediadoras, las proteínas BRD4 y otra maquinaria de transcripción de la célula. ^{[ 17 ]}

La 5-metilcitosina (5-mC) es una forma metilada de la base de ADN citosina (ver figura). La 5-mC es un marcador epigenético que se encuentra predominantemente en las citosinas dentro de los dinucleótidos CpG, que consisten en una citosina seguida de una guanina que se lee en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN ( sitios CpG ). Alrededor de 28 millones de dinucleótidos CpG se encuentran en el genoma humano . ^{[ 28 ]} En la mayoría de los tejidos de los mamíferos, en promedio, del 70% al 80% de las citosinas CpG están metiladas (formando 5-metil-CpG, o 5-mCpG). ^{[ 29 ]} Las citosinas metiladas dentro de las secuencias CpG a menudo se encuentran en grupos, llamados islas CpG . Alrededor del 59% de las secuencias promotoras tienen una isla CpG, mientras que solo alrededor del 6% de las secuencias potenciadoras tienen una isla CpG. ^{[ 30 ]} Las islas CpG constituyen secuencias reguladoras, ya que si las islas CpG se metilan en el promotor de un gen, esto puede reducir o silenciar la expresión génica. ^{[ 31 ]}

La metilación del ADN regula la expresión génica mediante la interacción con proteínas del dominio de unión a metilo (MBD), como MeCP2, MBD1 y MBD2. Estas proteínas MBD se unen con mayor afinidad a las islas CpG altamente metiladas . ^{[ 32 ]} Estas proteínas MBD poseen tanto un dominio de unión a metil-CpG como un dominio de represión transcripcional. ^{[ 32 ]} Se unen al ADN metilado y guían o dirigen complejos proteicos con actividad de remodelación de la cromatina y/o modificación de histonas hacia las islas CpG metiladas. Las proteínas MBD generalmente reprimen la cromatina local mediante mecanismos como la catálisis de la introducción de marcas de histonas represivas o la creación de un entorno de cromatina represivo general a través de la remodelación de nucleosomas y la reorganización de la cromatina. ^{[ 32 ]}

Los factores de transcripción son proteínas que se unen a secuencias de ADN específicas para regular la expresión de un gen determinado. La secuencia de unión de un factor de transcripción en el ADN suele tener entre 10 y 11 nucleótidos de longitud. Existen aproximadamente 1400 factores de transcripción diferentes codificados en el genoma humano, que constituyen alrededor del 6 % de todos los genes humanos que codifican proteínas. ^{[ 33 ]} Alrededor del 94 % de los sitios de unión de factores de transcripción asociados a genes sensibles a señales se encuentran en potenciadores, mientras que solo alrededor del 6 % de estos sitios se encuentran en promotores. ^{[ 9 ]}

EGR1 es un factor de transcripción importante para la regulación de la metilación de las islas CpG. Un sitio de unión del factor de transcripción EGR1 se encuentra frecuentemente en secuencias potenciadoras o promotoras. ^{[ 34 ]} Existen alrededor de 12 000 sitios de unión para EGR1 en el genoma de los mamíferos, y aproximadamente la mitad de estos sitios se encuentran en promotores y la otra mitad en potenciadores. ^{[ 34 ]} La unión de EGR1 a su sitio de unión de ADN diana es insensible a la metilación de la citosina en el ADN. ^{[ 34 ]}

Aunque solo se detectan pequeñas cantidades de proteína EGR1 en células no estimuladas, la traducción de EGR1 a proteína una hora después de la estimulación se eleva notablemente. ^{[ 35 ]} La expresión de EGR1 en varios tipos de células puede ser estimulada por factores de crecimiento, neurotransmisores, hormonas, estrés y lesiones. ^{[ 35 ]} En el cerebro, cuando las neuronas se activan, las proteínas EGR1 se regulan positivamente y se unen (reclutan) a las enzimas TET1 preexistentes, que se expresan en gran medida en las neuronas. Las enzimas TET pueden catalizar la desmetilación de la 5-metilcitosina. Cuando los factores de transcripción EGR1 llevan las enzimas TET1 a los sitios de unión de EGR1 en los promotores, las enzimas TET pueden desmetilar las islas CpG metiladas en esos promotores. Tras la desmetilación, estos promotores pueden entonces iniciar la transcripción de sus genes diana. Cientos de genes en las neuronas se expresan diferencialmente después de la activación neuronal a través del reclutamiento de TET1 por parte de EGR1 a secuencias reguladoras metiladas en sus promotores. ^{[ 34 ]}

Aproximadamente 600 secuencias reguladoras en promotores y aproximadamente 800 secuencias reguladoras en potenciadores parecen depender de rupturas de doble cadena iniciadas por la topoisomerasa 2β (TOP2B) para su activación. ^{[ 36 ] [ 37 ]} La inducción de rupturas de doble cadena particulares es específica con respecto a la señal inductora. Cuando las neuronas se activan in vitro , solo 22 rupturas de doble cadena inducidas por TOP2B ocurren en sus genomas. ^{[ 38 ]} Sin embargo, cuando se lleva a cabo un condicionamiento de miedo contextual en un ratón, este condicionamiento causa cientos de DSB asociadas a genes en la corteza prefrontal medial y el hipocampo, que son importantes para el aprendizaje y la memoria. ^{[ 39 ]}

Estas roturas de doble cadena inducidas por TOP2B están acompañadas por al menos cuatro enzimas de la vía de reparación del ADN por unión de extremos no homólogos (NHEJ) (DNA-PKcs, KU70, KU80 y DNA LIGASE IV) (véase la figura). Estas enzimas reparan las roturas de doble cadena en un plazo de entre 15 minutos y 2 horas. ^{[ 38 ] [ 40 ]} Por lo tanto, las roturas de doble cadena en el promotor están asociadas con TOP2B y al menos con estas cuatro enzimas de reparación. Estas proteínas están presentes simultáneamente en un único nucleosoma del promotor (hay aproximadamente 147 nucleótidos en la secuencia de ADN que rodea un único nucleosoma) situado cerca del sitio de inicio de la transcripción de su gen diana. ^{[ 40 ]}

La rotura de doble cadena introducida por TOP2B aparentemente libera la parte del promotor en un sitio de inicio de transcripción unido a la ARN polimerasa para que se mueva físicamente a su potenciador asociado. Esto permite que el potenciador, con sus factores de transcripción y proteínas mediadoras unidas, interactúe directamente con la ARN polimerasa que se había detenido en el sitio de inicio de transcripción para iniciar la transcripción. ^{[ 38 ] [ 10 ]}

De manera similar, las enzimas topoisomerasa I (TOP1) parecen estar ubicadas en muchos potenciadores, y estos potenciadores se activan cuando TOP1 introduce una ruptura de cadena simple. ^{[ 41 ]} TOP1 causa rupturas de cadena simple en secuencias reguladoras de ADN de potenciadores particulares cuando es señalizada por un factor de transcripción específico que se une al potenciador. ^{[ 41 ]} Las rupturas de topoisomerasa I están asociadas con factores de reparación de ADN diferentes a los que rodean las rupturas de TOP2B. En el caso de TOP1, las rupturas están asociadas más inmediatamente con las enzimas de reparación de ADN MRE11 , RAD50 y ATR . ^{[ 41 ]}

Las secuencias reguladoras del gen de la insulina son: ^{[ 43 ]}

• A5
• Z
• elemento regulador negativo (NRE) ^{[ 44 ]}
• C2
• E2
• A3
• elemento de respuesta de cAMP
• A2
• Unión del potenciador CAAT (CEB)
• C1
• E1
• G1