Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

β-galactosidasa

La β-galactosidasa (EC 3.2.1.23, beta-gal o β-gal ; nombre sistemático β- D -galactósido galactohidrolasa ) es una enzima glicósido hidrolasa que cataliza la hidrólisis de los r...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

La β-galactosidasa (EC 3.2.1.23, beta-gal o β-gal ; nombre sistemático β- D -galactósido galactohidrolasa ) es una enzima glicósido hidrolasa que cataliza la hidrólisis de los residuos terminales no reductores de β- D -galactosa en los β- D -galactósidos. (Esta enzima digiere muchos β-galactósidos, no solo la lactosa. A veces se la denomina informalmente lactasa , pero ese nombre generalmente se reserva para las enzimas digestivas de mamíferos que descomponen específicamente la lactosa).

Los β-galactósidos incluyen carbohidratos que contienen galactosa , donde el enlace glucosídico se encuentra sobre la molécula de galactosa. Los sustratos de diferentes β-galactosidasas incluyen el gangliósido GM1, las lactosilceramidas, la lactosa y diversas glicoproteínas . [ 1 ]

Función

La β-galactosidasa es una exoglicosidasa que hidroliza el enlace β-glucosídico formado entre una galactosa y su grupo orgánico. También puede escindir fucósidos y arabinósidos, pero a una velocidad mucho menor. Es una enzima esencial en el cuerpo humano. Las deficiencias de esta proteína pueden provocar galactosialidosis o síndrome de Morquio B. En E. coli , el gen lacZ es el gen estructural de la β-galactosidasa, que forma parte del operón lac del sistema inducible , el cual se activa en presencia de lactosa cuando el nivel de glucosa es bajo. La síntesis de β-galactosidasa se detiene cuando los niveles de glucosa son suficientes. [ 2 ]

La β-galactosidasa tiene muchos homólogos basados ​​en secuencias similares. Algunos son la β-galactosidasa evolucionada (EBG), la β-glucosidasa , la 6-fosfo-β-galactosidasa, la β-manosidasa y la lactasa-florizina hidrolasa. Aunque pueden ser estructuralmente similares, todos tienen funciones diferentes. [ 3 ] La β-galactosidasa es inhibida por la L -ribosa y por los inhibidores competitivos 2-feniletil 1-tio-β- D -galactopiranósido (PETG), D -galactonolactona, isopropil tio-β- D -galactósido (IPTG) y galactosa. [ 4 ]

La β-galactosidasa es importante para los organismos, ya que es un proveedor clave en la producción de energía y una fuente de carbono mediante la descomposición de la lactosa en galactosa y glucosa. También es importante para las personas con intolerancia a la lactosa, ya que es responsable de la producción de leche sin lactosa y otros productos lácteos. Muchos adultos carecen de la enzima lactasa , que tiene la misma función que la β-galactosidasa, por lo que no pueden digerir correctamente los productos lácteos. La β-galactosa se utiliza en productos lácteos como el yogur, la crema agria y algunos quesos, que se tratan con esta enzima para descomponer la lactosa antes de su consumo. En los últimos años, se ha investigado la β-galactosidasa como un posible tratamiento para la intolerancia a la lactosa mediante terapia de reemplazo genético, en la que podría insertarse en el ADN humano para que las personas puedan descomponer la lactosa por sí mismas. [ 5 ] [ 6 ]

Estructura

Los 1023 aminoácidos de la β-galactosidasa de E. coli fueron secuenciados en 1983, [ 7 ] y su estructura se determinó once años después, en 1994. La proteína es un homotetrámero de 464 kDa con simetría de 2,2,2 puntos . [ 8 ] Cada unidad de β-galactosidasa consta de cinco dominios ; el dominio 1 es un barril β de tipo rollo de gelatina , los dominios 2 y 4 son barriles similares a la fibronectina de tipo III , el dominio 5 es un sándwich β novedoso, mientras que el dominio central 3 es un barril de tipo TIM distorsionado , que carece de la quinta hélice y presenta una distorsión en la sexta hebra. [ 8 ]

El tercer dominio contiene el sitio activo. [ 9 ] El sitio activo está formado por elementos de dos subunidades del tetrámero, y la disociación del tetrámero en dímeros elimina elementos críticos del sitio activo. La secuencia amino-terminal de la β-galactosidasa, el α-péptido involucrado en la α-complementación, participa en una interfaz de subunidades. Sus residuos 22-31 ayudan a estabilizar un haz de cuatro hélices que forma la mayor parte de esa interfaz, y los residuos 13 y 15 también contribuyen a la interfaz de activación. Estas características estructurales proporcionan una justificación para el fenómeno de la α-complementación, donde la eliminación del segmento amino-terminal resulta en la formación de un dímero inactivo.

Reacción

reacción de β-galactosidasa

La β-galactosidasa puede catalizar tres reacciones diferentes en los organismos. En una de ellas, puede pasar por un proceso llamado transgalactosilación para producir alolactosa , creando un bucle de retroalimentación positiva para la producción de β-galactosa. La alolactosa también puede escindirse para formar monosacáridos. También puede hidrolizar la lactosa en galactosa y glucosa , que luego participan en la glucólisis . [ 3 ] El sitio activo de la β-galactosidasa cataliza la hidrólisis de su sustrato disacárido mediante la unión "superficial" (sitio no productivo) y "profunda" (sitio productivo). Los galactósidos como el PETG y el IPTG se unen al sitio superficial cuando la enzima está en conformación "abierta", mientras que los análogos del estado de transición como la L -ribosa y la D -galactonolactona se unen al sitio profundo cuando la conformación está "cerrada". [ 4 ]

La reacción enzimática consta de dos pasos químicos: galactosilación y desgalactosilación. La galactosilación es el primer paso químico de la reacción, donde Glu461 dona un protón a un oxígeno glucosídico, lo que resulta en la unión covalente de la galactosa con Glu537. En el segundo paso, la desgalactosilación, el enlace covalente se rompe cuando Glu461 acepta un protón, reemplazando la galactosa por agua. Se producen dos estados de transición en el sitio profundo de la enzima durante la reacción, uno después de cada paso. Cuando el agua participa en la reacción, se forma galactosa; de lo contrario, cuando la D -glucosa actúa como aceptor en el segundo paso, ocurre la transgalactosilación. [ 4 ] Se ha medido cinéticamente que los tetrámeros individuales de la proteína catalizan reacciones a una velocidad de 38 500 ± 900 reacciones por minuto. [ 10 ] Los iones de potasio monovalentes (K + ) y los iones de magnesio divalentes (Mg 2+ ) son necesarios para la actividad óptima de la enzima. El enlace β del sustrato se escinde por un grupo carboxilo terminal en la cadena lateral de un ácido glutámico .

La imagen de la izquierda es un diagrama de cintas de la beta-galactosidasa que muestra la ubicación de Glu 461, Glu 537 y Gly 794. La imagen de la derecha es una versión ampliada que muestra la interacción entre los aminoácidos.

En E. coli , se creía que Glu-461 era el nucleófilo en la reacción de sustitución . [ 11 ] Sin embargo, ahora se sabe que Glu-461 es un catalizador ácido . En cambio, Glu-537 es el nucleófilo real, [ 12 ] uniéndose a un intermedio galactosilado. En humanos , el nucleófilo de la reacción de hidrólisis es Glu-268. [ 13 ] Gly794 es importante para la actividad de la β-galactosidasa. Es responsable de colocar la enzima en una conformación "cerrada", unida al ligando, o en una conformación "abierta", actuando como una "bisagra" para el bucle del sitio activo. Las diferentes conformaciones aseguran que solo ocurra una unión preferencial en el sitio activo. En presencia de un sustrato lento, la actividad de Gly794 aumentó, así como un aumento en la galactosilación y una disminución en la desgalactosilación. [ 4 ]

Aplicaciones

El ensayo de β-galactosidasa se utiliza frecuentemente en genética , biología molecular y otras ciencias de la vida . [ 14 ] Una enzima activa puede detectarse utilizando el sustrato cromogénico artificial 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β- D -galactopiranósido, X-gal . La β-galactosidasa escindirá el enlace glucosídico en X-gal y formará galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol que se dimeriza y oxida a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo, un producto azul intenso que es fácil de identificar y cuantificar. [ 15 ] Se utiliza, por ejemplo, en pantalla azul-blanca . [ 16 ] Su producción puede ser inducida por un análogo no hidrolizable de la alolactosa , IPTG , que se une y libera al represor lac del operador lac, permitiendo así que se inicie la transcripción.

Se utiliza comúnmente en biología molecular como marcador reportero para monitorizar la expresión génica. También presenta un fenómeno denominado α-complementación, que constituye la base del cribado azul/blanco de clones recombinantes. Esta enzima puede dividirse en dos péptidos, LacZ α y LacZ Ω , ninguno de los cuales es activo por sí solo, pero cuando ambos están presentes juntos, se reensamblan espontáneamente para formar una enzima funcional. Esta propiedad se aprovecha en muchos vectores de clonación , donde la presencia del gen lacZα en un plásmido puede complementar en trans otro gen mutante que codifica LacZΩ en cepas de laboratorio específicas de E. coli . Sin embargo, cuando se insertan fragmentos de ADN en el vector, se interrumpe la producción de LacZα, por lo que las células no muestran actividad β-galactosidasa. La presencia o ausencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse mediante X-gal , que produce un colorante azul característico al ser escindido por la β-galactosidasa, lo que proporciona un medio sencillo para distinguir la presencia o ausencia del producto clonado en un plásmido. En estudios de translocaciones cromosómicas de leucemia, Dobson y sus colegas utilizaron una proteína de fusión de LacZ en ratones, [ 17 ] aprovechando la tendencia de la β-galactosidasa a oligomerizarse para sugerir un posible papel de la oligomerización en la función de la proteína de fusión MLL. [ 18 ]

Un estudio reciente realizado entre 2020 y 2021 determinó que la actividad de la β-galactosidasa se correlaciona con la senescencia celular . La senescencia celular es el proceso por el cual las células no se dividen, pero tampoco mueren. En las células senescentes, la actividad de la β-galactosidasa puede sobreexpresarse, lo que puede provocar diversas enfermedades que afectan a una amplia gama de sistemas corporales. Estos sistemas incluyen el sistema cardiovascular, el sistema esquelético y muchos más. La detección de células senescentes se puede lograr midiendo la actividad de la β-galactosidasa lisosomal. [ 19 ]

Se hipotetizó la existencia de una isoforma particular de β-galactosidasa expresada exclusivamente por células senescentes porque solo este tipo de células mostraba actividad de β-galactosidasa a pH 6,0 (beta-gal asociada a la senescencia o SA-beta-gal ). [ 20 ] Incluso se desarrollaron ensayos cuantitativos específicos para su detección. [ 21 ] [ 15 ] [ 22 ] Sin embargo, ahora se sabe que este fenómeno ocurre debido a una sobreexpresión y acumulación de la β-galactosidasa endógena lisosomal, [ 23 ] y por lo tanto no representa una isoforma distinta de β-galactosidasa, ni es un fenotipo requerido para la progresión o el mantenimiento del estado senescente. No obstante, sigue siendo el biomarcador más utilizado para células senescentes y envejecidas, porque es fiable y fácil de detectar.

Evolución

Algunas especies de bacterias, incluyendo E. coli , tienen genes adicionales de β-galactosidasa. Un segundo gen, llamado gen de β-galactosidasa evolucionada ( ebgA ), fue descubierto cuando cepas con el gen lacZ eliminado (pero que aún contenían el gen de la permeasa de galactósido, lacY ) fueron sembradas en un medio que contenía lactosa (u otros 3-galactósidos) como única fuente de carbono. Después de un tiempo, ciertas colonias comenzaron a crecer. Sin embargo, la proteína EbgA es una lactasa ineficaz y no permite el crecimiento en lactosa. Dos clases de mutaciones puntuales mejoran drásticamente la actividad de la enzima ebg hacia la lactosa. [ 24 ] [ 25 ] y, como resultado, la enzima mutante puede reemplazar a la β-galactosidasa lacZ. [ 26 ] EbgA y LacZ son 50% idénticas a nivel de ADN y 33% idénticas a nivel de aminoácidos. [ 27 ] La enzima ebg activa es un agregado de productos de los genes ebgA y ebgC en una proporción 1:1, siendo la forma activa de las enzimas ebg un hetero-octámero α 4 β4. [ 28 ]

Distribución de las especies

Gran parte del trabajo realizado sobre la β-galactosidasa se deriva de E. coli. Sin embargo, la enzima se puede encontrar en muchas plantas (especialmente frutas), mamíferos, levaduras, bacterias y hongos. [ 29 ] Los genes de la β-galactosidasa pueden diferir en la longitud de su secuencia codificante y la longitud de las proteínas formadas por aminoácidos. [ 30 ] Esto separa las β-galactosidasas en cuatro familias: GHF-1, GHF-2, GHF-35 y GHF-42. [ 31 ] E. coli pertenece a GHF-2, todas las plantas pertenecen a GHF-35 y Thermus thermophilus pertenece a GHF-42. [ 31 ] [ 30 ] Varias frutas pueden expresar múltiples genes de β-galactosidasa. Hay al menos siete genes de β-galactosidasa expresados ​​en el desarrollo del fruto del tomate, que tienen una similitud de aminoácidos entre el 33% y el 79%. [ 32 ] Un estudio dirigido a identificar el ablandamiento de la fruta de los duraznos encontró 17 expresiones genéticas diferentes de β-galactosidasas. [ 30 ] La única otra estructura cristalina conocida de β-galactosidasa es de Thermus thermophilus . [ 31 ]

Referencias

  1. ↑ Diccionario médico ilustrado de Dorland . Archivado del original el 16 de octubre de 2006. Consultado el 22 de octubre de 2006 .
  2. ↑ Garrett R (2013). Bioquímica . Belmont, CA: Cengage Learning. pág. 1001. ISBN  978-1133106296.
  3. 1 2 "Glicósido hidrolasa, familia 1, β-glucosidasa (IPR017736) < InterPro < EMBL-EBI" . www.ebi.ac.uk. Consultado el 11 de diciembre de 2015 .
  4. ^ Juers DH, Hakda S, Matthews BW , Huber RE (noviembre de 2003 ) . "Base estructural de la actividad alterada de las variantes Gly794 de la β-galactosidasa de Escherichia coli ". Bioquímica . 42 (46): 13505– 11. doi : 10.1021/bi035506j . PMID 14621996 . 
  5. ↑ Salehi S, Eckley L, Sawyer GJ, Zhang X, Dong X, Freund JN, Fabre JW (enero de 2009). "Lactasa intestinal como gen reportero de β-galactosidasa autólogo para estudios de expresión génica in vivo". Human Gene Therapy . 20 (1): 21– 30. doi : 10.1089/hum.2008.101 . PMID 20377368 . 
  6. ^ Ishikawa K, Kataoka M, Yanamoto T, Nakabayashi M, Watanabe M, Ishihara S, Yamaguchi S (julio de 2015). "Estructura cristalina de la β-galactosidasa de Bacillus circulans ATCC 31382 (BgaD) y la construcción de los mutantes termófilos" . El Diario FEBS . 282 (13): 2540– 52. doi : 10.1111/feb.13298 . PMID 25879162 . S2CID 33928719 .  
  7. ↑ Kalnins A, Otto K, Rüther U, Müller-Hill B (1983). "Secuencia del gen lacZ de Escherichia coli" . The EMBO Journal . 2 (4): 593– 7. doi : 10.1002/j.1460-2075.1983.tb01468.x . PMC 555066. PMID 6313347 .  
  8. 1 2 Jacobson RH, Zhang XJ, DuBose RF, Matthews BW (junio de 1994). "Estructura tridimensional de la β-galactosidasa de E. coli " . Nature . 369 (6483): 761– 6. Bibcode : 1994Natur.369..761J . doi : 10.1038/369761a0 . PMID 8008071. S2CID 4241867 .  
  9. ^ Matthews BW (junio de 2005). "La estructura de la β-galactosidasa de E. coli " . Comptes Rendus Biologías . 328 (6): 549– 56. doi : 10.1016/j.crvi.2005.03.006 . PMID 15950161 . 
  10. ↑ Juers DH, Matthews BW, Huber RE (diciembre de 2012). "LacZ β-galactosidasa: estructura y función de una enzima de importancia histórica y biológica molecular" . Protein Science . 21 (12): 1792–807 . doi : 10.1002/pro.2165 . PMC 3575911. PMID 23011886 .  
  11. ↑ Gebler JC, Aebersold R, Withers SG (junio de 1992). "Glu-537, no Glu-461, es el nucleófilo en el sitio activo de la β-galactosidasa (lac Z) de Escherichia coli " . The Journal of Biological Chemistry . 267 (16): 11126–30 . doi : 10.1016/S0021-9258(19)49884-0 . PMID 1350782 . 
  12. ↑ Yuan J, Martinez-Bilbao M, Huber RE (abril de 1994). "Las sustituciones de Glu-537 de la β-galactosidasa de Escherichia coli provocan grandes disminuciones en la actividad catalítica" . The Biochemical Journal . 299 (Pt 2): 527–31 . doi : 10.1042/bj2990527 . PMC 1138303. PMID 7909660 .  
  13. ↑ McCarter JD, Burgoyne DL, Miao S, Zhang S, Callahan JW, Withers SG (enero de 1997). "Identificación de Glu-268 como el nucleófilo catalítico del precursor de la β-galactosidasa lisosomal humana mediante espectrometría de masas" ( PDF) . The Journal of Biological Chemistry . 272 ​​(1): 396– 400. doi : 10.1074/jbc.272.1.396 . PMID 8995274. S2CID 35101194 .  
  14. ↑ Ninfa AJ, Ballou DP (2009). Enfoques fundamentales de laboratorio para la bioquímica y la biotecnología . ISBN 978-0-470-47131-9.
  15. 1 2 Gary RK, Kindell SM (agosto de 2005). "Ensayo cuantitativo de la actividad de la beta-galactosidasa asociada a la senescencia en extractos de células de mamíferos". Analytical Biochemistry . 343 (2): 329– 34. doi : 10.1016/j.ab.2005.06.003 . PMID 16004951 . 
  16. ↑ Ensayo de β-galactosidasa (Un Miller mejorado) - OpenWetWare
  17. ↑ Dobson CL, Warren AJ, Pannell R, Forster A, Rabbitts TH (marzo de 2000). "Tumorigénesis en ratones con una fusión del oncogén de leucemia Mll y el gen bacteriano lacZ" . The EMBO Journal . 19 (5): 843– 51. doi : 10.1093/emboj/19.5.843 . PMC 305624. PMID 10698926 .  
  18. ↑ Krivtsov AV, Armstrong SA (noviembre de 2007). "Translocaciones de MLL, modificaciones de histonas y desarrollo de células madre leucémicas". Nature Reviews. Cancer . 7 (11): 823– 33. doi : 10.1038/nrc2253 . PMID 17957188. S2CID 9183717 .  
  19. ↑ Lozano Torres, Beatriz; Blandez, Juan F.; Sancenón, Félix; Martínez-Máñez, Ramón (abril 2021). "Sondas cromofluorogénicas para la detección de β-galactosidasa" . Química Analítica y Bioanalítica . 413 (9): 2361– 2388. doi : 10.1007/s00216-020-03111-8 . hdl : 10251/180327 . ISSN 1618-2642 . PMID 33606064 . S2CID 231957317 .   
  20. ↑ Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Roskelley C, et al. (septiembre de 1995). "Un biomarcador que identifica células humanas senescentes en cultivo y en piel envejecida in vivo" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 92 (20): 9363–7 . Bibcode : 1995PNAS...92.9363D . doi : 10.1073/pnas.92.20.9363 . PMC 40985. PMID 7568133 .   
  21. ↑ Bassaneze V, Miyakawa AA, Krieger JE (enero de 2008). "Un método quimioluminiscente cuantitativo para estudiar la senescencia prematura replicativa e inducida por estrés en cultivos celulares". Analytical Biochemistry . 372 (2): 198– 203. doi : 10.1016/j.ab.2007.08.016 . PMID 17920029 . 
  22. ↑ Itahana K, Campisi J, Dimri GP (2007). "Métodos para detectar biomarcadores de senescencia celular" . Envejecimiento biológico . Métodos en biología molecular. Vol. 371. Humana Press. págs. 21–31 . doi : 10.1007/978-1-59745-361-5_3 . ISBN   978-1-58829-658-0. PMID 17634571 . 
  23. ↑ Lee BY, Han JA, Im JS, Morrone A, Johung K, Goodwin EC, et al. (abril de 2006). "La β-galactosidasa asociada a la senescencia es la β-galactosidasa lisosomal". Aging Cell . 5 (2): 187– 95. doi : 10.1111/j.1474-9726.2006.00199.x . hdl : 2158/216175 . PMID 16626397. S2CID 82432911 .   
  24. ↑ Hall BG (enero de 1977). " Número de mutaciones necesarias para desarrollar una nueva función de lactasa en Escherichia coli " . Journal of Bacteriology . 129 (1): 540–3 . doi : 10.1128/JB.129.1.540-543.1977 . PMC 234956. PMID 318653 .  
  25. ↑ Hall BG (julio de 1981). "Cambios en las especificidades de sustrato de una enzima durante la evolución dirigida de nuevas funciones". Biochemistry . 20 (14): 4042–9 . doi : 10.1021/bi00517a015 . PMID 6793063 . 
  26. ↑ Hall BG (octubre de 1976). "Evolución experimental de una nueva función enzimática. Análisis cinético de las enzimas ancestrales (ebg) y evolucionadas (ebg)". Journal of Molecular Biology . 107 (1): 71– 84. doi : 10.1016/s0022-2836(76)80018-6 . PMID 794482 . 
  27. ↑ Stokes HW, Betts PW, Hall BG (noviembre de 1985). "Secuencia del gen ebgA de Escherichia coli : comparación con el gen lacZ" . Biología molecular y evolución . 2 (6): 469–77 . doi : 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040372 . PMID 3939707 . 
  28. ↑ Elliott AC, KS, Sinnott ML, Smith PJ, Bommuswamy J, Guo Z, et al. (febrero de 1992). "Las consecuencias catalíticas de la evolución experimental. Estudios sobre la estructura de subunidades de la segunda (ebg) β-galactosidasa de Escherichia coli y sobre la catálisis por ebgab, un evolucionante experimental que contiene dos sustituciones de aminoácidos" . The Biochemical Journal . 282 (Pt 1) (1): 155–64 . doi : 10.1042/bj2820155 . PMC 1130902. PMID 1540130 .   
  29. ↑ Richmond ML, Gray JI, Stine CM (1981). "β-Galactosidasa: Revisión de investigaciones recientes relacionadas con la aplicación tecnológica, las preocupaciones nutricionales y la inmovilización" . Journal of Dairy Science . 64 (9): 1759– 1771. doi : 10.3168/jds.s0022-0302(81)82764-6 . ISSN 0022-0302 . 
  30. 1 2 3 Guo S, Song J, Zhang B, Jiang H, Ma R, Yu M (2018). "Identificación a nivel genómico y análisis de expresión de miembros de la familia de la β-galactosidasa durante el ablandamiento del fruto del melocotón [ Prunus persica (L.) Batsch]". Postharvest Biology and Technology . 136 : 111– 123. doi : 10.1016/j.postharvbio.2017.10.005 .
  31. ^ Rojas AL, Nagem RA, Neustroev KN, Arand M, Adamska M, Eneyskaya EV, et al . (noviembre de 2004). "Estructuras cristalinas de β-galactosidasa de Penicillium sp. Y su complejo con galactosa". Revista de biología molecular . 343 (5): 1281– 92. doi : 10.1016/j.jmb.2004.09.012 . PMID 15491613 .  
  32. ↑ Smith DL, Gross KC (julio de 2000). "Una familia de al menos siete genes de β-galactosidasa se expresa durante el desarrollo del fruto del tomate" . Plant Physiology . 123 (3): 1173–83 . doi : 10.1104/pp.123.3.1173 . PMC 59080. PMID 10889266 .