Secuencia química

Chem-seq es una técnica que se utiliza para mapear las interacciones a nivel genómico entre moléculas pequeñas y sus proteínas diana en la cromatina de los núcleos de células eucariotas . ^{[ 1 ]} El método emplea captura por afinidad química junto con secuenciación masiva paralela de ADN para identificar sitios genómicos donde las moléculas pequeñas interactúan con sus proteínas o ADN diana. Fue descrito por primera vez por Lars Anders et al. en la edición de enero de 2014 de " Nature Biotechnology ".

Un número considerable de ligandos de moléculas pequeñas , incluidos fármacos terapéuticos, ejercen sus efectos mediante la unión a proteínas específicas asociadas al genoma. El mapeo de las interacciones globales de estas entidades químicas con la cromatina a nivel genómico podría proporcionar información sobre los mecanismos por los cuales una molécula pequeña influye en las funciones celulares. Combinado con otras técnicas de análisis de cromatina como ChIP-seq , ^{[ 2 ]} Chem-seq puede utilizarse para investigar los efectos a nivel genómico de las modalidades terapéuticas y para comprender los efectos de los fármacos en la arquitectura nuclear en diversos contextos biológicos. En un sentido más amplio, estos métodos serán útiles para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos terapéuticos mediante los cuales las moléculas pequeñas modulan la función y la actividad de las proteínas asociadas al genoma. ^{[ 1 ]} Mediante la identificación de las dianas celulares de un fármaco, es posible obtener una mayor comprensión de las causas de los efectos secundarios y la toxicidad en las primeras etapas del desarrollo de fármacos, lo que debería ayudar a reducir la tasa de abandono en el desarrollo. ^{[ 3 ]}

La secuenciación química (chem-seq) se basa en la capacidad de crear una versión biotinilada de una molécula pequeña de interés para permitir la captura por afinidad posterior . La secuenciación química puede realizarse in vitro o in vivo , aunque los resultados de ambos métodos han demostrado ser muy similares. ^{[ 1 ]}

Secuencia química in vivo

Durante el Chem-seq in vivo , ^{[ 1 ]} las células cultivadas en medio se tratan simultáneamente con una versión biotinilada de la molécula pequeña en estudio o con DMSO (como control) y formaldehído al 1% para la reticulación de ADN, proteínas y moléculas pequeñas. A continuación, se extrae el ADN de las células, se sonica y se enriquece para regiones que contienen la molécula biotinilada de interés mediante incubación con perlas magnéticas de estreptavidina , que tienen una afinidad muy alta por la biotina. La fracción de ADN enriquecida se purifica, se eluye de las perlas y se somete a secuenciación de nueva generación. Las regiones genómicas enriquecidas en la biblioteca Chem-seq en relación con el control están asociadas con la molécula pequeña en estudio.

Secuencia química in vitro

La secuenciación química in vitro ^{[ 1 ]} comienza con la reticulación de células cultivadas en un medio con formaldehído al 0,5 %. A continuación, se extraen los núcleos celulares y su ADN. Este extracto se sonica antes de incubarlo con microesferas magnéticas de estreptavidina unidas a una forma biotinilada del compuesto de interés. Esto permite que la molécula de interés interactúe con sus regiones genómicas diana. Posteriormente, estas regiones genómicas se aíslan mediante un imán y se someten a secuenciación de nueva generación y análisis para determinar las regiones enriquecidas con la molécula de interés.

Se probó Chem-seq en tres clases de fármacos utilizando células de mieloma múltiple MM1.S para: ^{[ 1 ]}

1) Investigar la unión a nivel genómico del inhibidor de bromodominio JQ1 a los miembros de la familia de bromodominios BET BRD2 , BRD3 y BRD4.

2) Mapear los sitios de unión genómicos de AT7519 , un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina CDK9 , y

3) Estudiar cómo el agente intercalante de ADN psoraleno interactúa con el ADN genómico in vivo.

En los dos primeros ensayos, las señales de Chem-seq aparecieron en sitios genómicos ocupados por las proteínas diana correspondientes de los fármacos y fueron concordantes con los resultados de ChIP-seq. Sin embargo, bio-AT7519 produjo señales de Chem-seq más débiles en comparación con las observadas para bio-JQ1. También hubo un número sustancial de loci que no fueron ocupados simultáneamente por bio-AT7519 y su diana CDK9, lo que podría atribuirse a la señal más débil obtenida para bio-AT7519 o porque AT7519 puede unirse e inhibir otras quinasas dependientes de ciclina como cdks 1, 2, 4, 5. ^{[ 1 ] [ 3 ]} En un tercer experimento, Chem-seq fue eficiente en el mapeo de sitios de unión genómicos del agente intercalante de ADN psoraleno y mostró que bio-psoraleno se une preferentemente al sitio de inicio de la transcripción de genes activos.

Ventajas

Chem-seq es el primer método que proporciona a los investigadores una forma de determinar la ubicación de moléculas pequeñas en todo el genoma. Puede utilizarse junto con ChIP-seq para correlacionar la ubicación de ciertos fármacos con proteínas de unión al ADN , como los factores de transcripción , para descubrir nuevas interacciones y ayudar a caracterizar los mecanismos moleculares mediante los cuales las moléculas pequeñas afectan al genoma.

Debido a que utiliza secuenciación de próxima generación para determinar los sitios de unión de moléculas pequeñas, Chem-seq tiene una sensibilidad muy alta y es compatible con otros métodos basados ​​en secuenciación de próxima generación.

Anteriormente, se utilizó otra técnica similar conocida como ensayo de precipitación de afinidad de cromatina (ChAP) para mapear los sitios de interacción de compuestos metabólicos en el genoma de la levadura, ^{[ 4 ]} pero Chem-seq es el primer método para evaluar la localización en todo el genoma de moléculas pequeñas en células de mamíferos.

Limitaciones

Para que Chem-seq sea viable, la molécula pequeña en estudio debe ser susceptible de biotinilación sin alterar sus propiedades de unión naturales. Esto simplemente no es posible con ciertas moléculas pequeñas, e incluso cuando lo es, el proceso puede requerir conocimientos especializados en química orgánica. Una vez sintetizado, deben probarse las propiedades de unión del compuesto biotinilado. Hasta la fecha, esto se ha logrado comparando la cinética de unión de los compuestos biotinilados y no modificados, ^{[ 1 ]} un proceso que requiere conocimiento previo de las proteínas a las que se une el compuesto.

Las ubicaciones de Bio-JQ1 en todo el genoma, determinadas mediante Chem-seq, son casi idénticas a las ubicaciones derivadas de ChIP-seq de la proteína diana conocida de JQ1, BRD4. ^{[ 1 ]} Si bien esto puede considerarse una prueba de la precisión del método, también pone de manifiesto redundancias entre las dos técnicas, especialmente cuando las proteínas diana son previamente conocidas.