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Articulo de referencia

Transformación genética

En esta imagen, un gen de una célula bacteriana se transfiere a otra célula bacteriana. Este proceso, en el que la segunda célula bacteriana incorpora nuevo material genético, s...

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En esta imagen, un gen de una célula bacteriana se transfiere a otra célula bacteriana. Este proceso, en el que la segunda célula bacteriana incorpora nuevo material genético, se denomina transformación.

En biología molecular y genética , la transformación es la alteración genética de una célula bacteriana resultante de la captación e incorporación directa de material genético exógeno de su entorno a través de la membrana celular . Para que se produzca la transformación, la bacteria receptora debe estar en un estado de competencia , que puede ocurrir en la naturaleza como una respuesta temporal a condiciones ambientales como la inanición y la densidad celular, y también puede inducirse en el laboratorio. [ 1 ]

La transformación es uno de los tres procesos que conducen a la transferencia horizontal de genes , en la cual el material genético exógeno pasa de una bacteria a otra; los otros dos son la conjugación (transferencia de material genético entre dos células bacterianas en contacto directo) y la transducción (inyección de ADN extraño por un virus bacteriófago en la bacteria huésped). [ 1 ] En la transformación, el material genético pasa a través del medio intermedio, y la captación depende completamente de la bacteria receptora. [ 1 ]

En 2014 se conocían alrededor de 80 especies de bacterias capaces de transformarse, divididas casi por igual entre bacterias Gram positivas y Gram negativas ; es posible que esta cifra sea una sobreestimación, ya que varios de los informes están respaldados por artículos individuales. [ 1 ]

El término "transformación" también puede utilizarse para describir la inserción de nuevo material genético en células no bacterianas, incluidas las células animales y vegetales; sin embargo, debido a que " transformación " tiene un significado especial en relación con las células animales, indicando la progresión a un estado canceroso, el proceso se denomina habitualmente " transfección ". [ 2 ]

Historia

La transformación en bacterias fue demostrada por primera vez en 1928 por el bacteriólogo británico Frederick Griffith . [ 3 ] Griffith estaba interesado en determinar si las inyecciones de bacterias inactivadas por calor podían usarse para vacunar ratones contra la neumonía. Sin embargo, descubrió que una cepa no virulenta de Streptococcus pneumoniae podía volverse virulenta después de ser expuesta a cepas virulentas inactivadas por calor. Griffith planteó la hipótesis de que algún " principio transformador " de la cepa inactivada por calor era responsable de hacer virulenta a la cepa inofensiva. En 1944, este "principio transformador" fue identificado como genético por Oswald Avery , Colin MacLeod y Maclyn McCarty . Aislaron ADN de una cepa virulenta de S. pneumoniae y, utilizando solo este ADN, lograron hacer virulenta a una cepa inofensiva. Denominaron a esta captación e incorporación de ADN por bacterias "transformación" (véase el experimento de Avery-MacLeod-McCarty ) [ 4 ]. Los resultados de los experimentos de Avery et al. fueron recibidos inicialmente con escepticismo por la comunidad científica, y no fue hasta el desarrollo de marcadores genéticos y el descubrimiento de otros métodos de transferencia genética ( conjugación en 1947 y transducción en 1953) por Joshua Lederberg que los experimentos de Avery fueron aceptados. [ 5 ]

Originalmente se pensaba que Escherichia coli , un organismo de laboratorio de uso común, era refractario a la transformación. Sin embargo, en 1970, Morton Mandel y Akiko Higa demostraron que E. coli puede ser inducida a incorporar ADN del bacteriófago λ sin el uso de fagos auxiliares después del tratamiento con una solución de cloruro de calcio. [ 6 ] Dos años más tarde, en 1972, Stanley Norman Cohen , Annie Chang y Leslie Hsu demostraron que CaClEl tratamiento 2 también es efectivo para la transformación de ADN plasmídico. [ 7 ] El método de transformación de Mandel y Higa fue mejorado posteriormente porDouglas Hanahan. [ 8 ] El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente enE. colicreó un procedimiento eficiente y conveniente para transformar bacterias que permitede clonación molecularenbiotecnologíaeinvestigación, y ahora es un procedimiento de laboratorio de uso rutinario.

La transformación mediante electroporación se desarrolló a finales de la década de 1980, aumentando la eficiencia de la transformación in vitro y el número de cepas bacterianas que podían transformarse. [ 9 ] También se investigó la transformación de células animales y vegetales, creándose el primer ratón transgénico mediante la inyección de un gen de la hormona del crecimiento de rata en un embrión de ratón en 1982. [ 10 ] En 1897 se descubrió una bacteria que causaba tumores en las plantas, Agrobacterium tumefaciens , y a principios de la década de 1970 se descubrió que el agente inductor del tumor era un plásmido de ADN llamado plásmido Ti . [ 11 ] Al eliminar los genes del plásmido que causaban el tumor y añadir nuevos genes, los investigadores pudieron infectar plantas con A. tumefaciens y permitir que las bacterias insertaran el ADN elegido en los genomas de las plantas. [ 12 ] No todas las células vegetales son susceptibles a la infección por A. tumefaciens , por lo que se desarrollaron otros métodos, incluyendo la electroporación y la microinyección . [ 13 ] El bombardeo de partículas fue posible gracias a la invención del Sistema de Entrega de Partículas Biolísticas (pistola genética) por John Sanford en la década de 1980. [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]

Definiciones

La transformación es una de las tres formas de transferencia horizontal de genes que ocurren en la naturaleza entre bacterias, en la que el ADN que codifica un rasgo pasa de una bacteria a otra y se integra en el genoma receptor por recombinación homóloga ; las otras dos son la transducción , llevada a cabo por medio de un bacteriófago , y la conjugación , en la que un gen se transmite por contacto directo entre bacterias. [ 1 ] En la transformación, el material genético pasa a través del medio intermedio, y la captación depende completamente de la bacteria receptora. [ 1 ]

La competencia se refiere a un estado temporal de capacidad para incorporar ADN exógeno del entorno; puede inducirse en un laboratorio. [ 1 ]

Parece ser un proceso ancestral heredado de un procariota común que constituye una adaptación beneficiosa para promover la reparación recombinacional del daño en el ADN, especialmente el daño adquirido en condiciones de estrés. La transformación genética natural parece ser una adaptación para la reparación del daño en el ADN que también genera diversidad genética . [ 1 ] [ 17 ]

La transformación se ha estudiado en especies de bacterias Gram negativas de importancia médica como Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae y Vibrio cholerae . [ 18 ] También se ha estudiado en especies Gram negativas que se encuentran en el suelo como Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi y patógenos de plantas Gram negativas como Ralstonia solanacearum y Xylella fastidiosa . [ 18 ] La transformación entre bacterias Gram positivas se ha estudiado en especies de importancia médica como Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus y Streptococcus sanguinis y en la bacteria del suelo Gram positiva Bacillus subtilis . [ 17 ] También se ha informado en al menos 30 especies de Pseudomonadota distribuidas en varias clases diferentes. [ 19 ] Los Pseudomonadota mejor estudiados con respecto a la transformación son los patógenos humanos de importancia médica Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae y Helicobacter pylori . [ 17 ]

El término "transformación" también puede utilizarse para describir la inserción de nuevo material genético en células no bacterianas, incluidas las células animales y vegetales; sin embargo, debido a que " transformación " tiene un significado especial en relación con las células animales, indicando la progresión a un estado canceroso, el proceso se denomina habitualmente " transfección ". [ 2 ]

Competencia natural y transformación

Las bacterias naturalmente competentes poseen conjuntos de genes que proporcionan la maquinaria proteica para transportar el ADN a través de la(s) membrana(s) celular(es). El transporte del ADN exógeno al interior de las células puede requerir proteínas implicadas en el ensamblaje de los pili de tipo IV y el sistema de secreción de tipo II , así como el complejo de translocasa de ADN en la membrana citoplasmática. [ 20 ]

Debido a las diferencias en la estructura de la envoltura celular entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, existen algunas diferencias en los mecanismos de captación de ADN en estas células; sin embargo, la mayoría comparte características comunes que involucran proteínas relacionadas. El ADN se une primero a la superficie de las células competentes en un receptor de ADN y atraviesa la membrana citoplasmática mediante una translocasa de ADN. [ 21 ] Solo el ADN monocatenario puede atravesarla, ya que la otra cadena se degrada por nucleasas durante el proceso. El ADN monocatenario translocado puede luego integrarse en los cromosomas bacterianos mediante un proceso dependiente de RecA . En las células Gram negativas, debido a la presencia de una membrana adicional, el ADN requiere la presencia de un canal formado por secretinas en la membrana externa. La pilina puede ser necesaria para la competencia, pero su función es incierta. [ 22 ] La captación de ADN generalmente no es específica de secuencia, aunque en algunas especies la presencia de secuencias específicas de captación de ADN puede facilitar una captación eficiente de ADN. [ 23 ]

Transformación natural

La transformación natural es una adaptación bacteriana para la transferencia de ADN que depende de la expresión de numerosos genes bacterianos cuyos productos parecen ser responsables de este proceso. [ 20 ] [ 19 ] En general, la transformación es un proceso de desarrollo complejo que requiere energía. Para que una bacteria pueda unirse, incorporar y recombinar ADN exógeno en su cromosoma, debe volverse competente, es decir, entrar en un estado fisiológico especial. El desarrollo de la competencia en Bacillus subtilis requiere la expresión de unos 40 genes. [ 24 ] El ADN integrado en el cromosoma del huésped generalmente (pero con raras excepciones) proviene de otra bacteria de la misma especie y, por lo tanto, es homólogo al cromosoma residente.

En B. subtilis, la longitud del ADN transferido es mayor de 1271 kb (más de 1 millón de bases). [ 25 ] Es probable que la longitud transferida sea ADN de doble cadena y suele ser más de un tercio de la longitud total del cromosoma de 4215 kb. [ 26 ] Parece que entre el 7 % y el 9 % de las células receptoras incorporan un cromosoma completo. [ 27 ]

La capacidad de transformación natural parece ocurrir en varios procariotas, y hasta ahora se sabe que 67 especies procariotas (en siete filos diferentes) experimentan este proceso. [ 19 ]

La competencia para la transformación se induce típicamente por una alta densidad celular y/o limitación nutricional, condiciones asociadas con la fase estacionaria del crecimiento bacteriano. La transformación en Haemophilus influenzae ocurre de manera más eficiente al final del crecimiento exponencial, cuando el crecimiento bacteriano se acerca a la fase estacionaria. [ 28 ] La transformación en Streptococcus mutans , así como en muchos otros estreptococos, ocurre a alta densidad celular y está asociada con la formación de biopelículas . [ 29 ] La competencia en B. subtilis se induce hacia el final del crecimiento logarítmico, especialmente en condiciones de limitación de aminoácidos. [ 30 ] De manera similar, en Micrococcus luteus (un representante del filo Actinomycetota menos estudiado ), la competencia se desarrolla durante la fase de crecimiento exponencial media-tardía y también se desencadena por la inanición de aminoácidos. [ 31 ] [ 32 ]

Se cree que ciertos bacteriófagos contribuyen a la transformación mediante la liberación de ADN intacto del huésped y del plásmido . [ 33 ]

La transformación, como adaptación para la reparación del ADN.

La competencia se induce específicamente por condiciones que dañan el ADN. Por ejemplo, la transformación se induce en Streptococcus pneumoniae por los agentes que dañan el ADN mitomicina C (un agente de entrecruzamiento de ADN) y fluoroquinolona (un inhibidor de la topoisomerasa que causa roturas de doble cadena). [ 34 ] En B. subtilis , la transformación aumenta por la luz UV, un agente que daña el ADN. [ 35 ] En Helicobacter pylori , la ciprofloxacina, que interactúa con la ADN girasa e introduce roturas de doble cadena, induce la expresión de genes de competencia, aumentando así la frecuencia de transformación [ 36 ] Utilizando Legionella pneumophila , Charpentier et al. [ 37 ] probaron 64 moléculas tóxicas para determinar cuáles de ellas inducen competencia. De estas, solo seis, todos agentes que dañan el ADN, causaron una fuerte inducción. Estos agentes dañinos para el ADN fueron la mitomicina C (que causa entrecruzamientos intercatenarios del ADN), la norfloxacina, la ofloxacina y el ácido nalidíxico (inhibidores de la ADN girasa que causan roturas de doble cadena [ 38 ] ), la biciclomicina (que causa roturas de cadena simple y doble [ 39 ] ) y la hidroxiurea (que induce la oxidación de las bases del ADN [ 40 ] ). La luz UV también indujo competencia en L. pneumophila . Charpentier et al. [ 37 ] sugirieron que la competencia para la transformación probablemente evolucionó como una respuesta al daño del ADN. La transformación natural en la bacteria extraordinariamente resistente a la radiación Deinococcus radiodurans está asociada con la reparación del daño del ADN en condiciones de estrés. [ 41 ]

Las bacterias en fase de crecimiento logarítmico difieren de las bacterias en fase estacionaria con respecto al número de copias del genoma presentes en la célula, lo que tiene implicaciones para la capacidad de llevar a cabo un importante proceso de reparación del ADN . Durante el crecimiento logarítmico, pueden existir dos o más copias de cualquier región particular del cromosoma en una célula bacteriana, ya que la división celular no coincide exactamente con la replicación cromosómica. El proceso de reparación por recombinación homóloga (HRR) es un proceso clave de reparación del ADN, especialmente eficaz para reparar daños de doble cadena, como roturas de doble cadena. Este proceso depende de un segundo cromosoma homólogo, además del cromosoma dañado. Durante el crecimiento logarítmico, un daño en el ADN de un cromosoma puede repararse mediante HRR utilizando información de secuencia del otro cromosoma homólogo. Sin embargo, una vez que las células se acercan a la fase estacionaria, normalmente solo tienen una copia del cromosoma, y ​​la HRR requiere la introducción de una plantilla homóloga externa a la célula mediante transformación. [ 42 ]

Para comprobar si la función adaptativa de la transformación es la reparación de daños en el ADN, se llevaron a cabo una serie de experimentos utilizando B. subtilis irradiado con luz UV como agente dañino (revisado por Michod et al. [ 43 ] y Bernstein et al. [ 42 ] ). Los resultados de estos experimentos indicaron que el ADN transformante actúa reparando daños potencialmente letales en el ADN receptor, inducidos por la luz UV. El proceso particular responsable de la reparación fue probablemente la recombinación homóloga (HRR). La transformación en bacterias puede considerarse un proceso sexual primitivo, ya que implica la interacción del ADN homólogo de dos individuos para formar ADN recombinante que se transmite a las generaciones siguientes. La transformación bacteriana en procariotas podría haber sido el proceso ancestral que dio origen a la reproducción sexual meiótica en eucariotas (véase Evolución de la reproducción sexual ; Meiosis ).

Métodos y mecanismos de transformación en laboratorio

Esquema de la transformación bacteriana, para la cual primero debe inducirse la competencia artificial.

Bacteriano

La competencia artificial puede inducirse en procedimientos de laboratorio que implican hacer que la célula sea pasivamente permeable al ADN al exponerla a condiciones que normalmente no ocurren en la naturaleza. [ 44 ] Típicamente, las células se incuban en una solución que contiene cationes divalentes (a menudo cloruro de calcio ) en condiciones de frío, antes de ser expuestas a un pulso de calor (choque térmico). El cloruro de calcio altera parcialmente la membrana celular, lo que permite que el ADN recombinante entre en la célula huésped. Las células que son capaces de incorporar el ADN se denominan células competentes.

Se ha descubierto que el crecimiento de bacterias Gram negativas en 20 mM de Mg reduce el número de enlaces proteína- lipopolisacárido al aumentar la proporción de enlaces iónicos a covalentes, lo que incrementa la fluidez de la membrana y facilita la transformación. [ 45 ] El papel de los lipopolisacáridos en este caso se verifica a partir de la observación de que las cadenas laterales O más cortas se transforman de manera más eficaz, quizás debido a una mayor accesibilidad del ADN.

La superficie de bacterias como la E. coli tiene carga negativa debido a los fosfolípidos y lipopolisacáridos presentes en su superficie celular, y el ADN también tiene carga negativa. Por lo tanto, una función del catión divalente sería neutralizar estas cargas coordinando los grupos fosfato y otras cargas negativas, permitiendo así que una molécula de ADN se adhiera a la superficie celular.

La entrada de ADN en las células de E. coli se produce a través de canales conocidos como zonas de adhesión o uniones de Bayer, y una célula típica puede contener hasta 400 de estas zonas. Su función se estableció cuando se descubrió que la cobalamina (que también utiliza estos canales) inhibe competitivamente la captación de ADN. Otro tipo de canal implicado en la captación de ADN consiste en poli(HB):poli P:Ca. En este caso, se postula que el poli(HB) se enrolla alrededor del ADN (que a su vez es un polifosfato) y es transportado por un escudo formado por iones de Ca. [ 45 ]

Se sugiere que la exposición de las células a cationes divalentes en condiciones de frío también puede alterar o debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable al ADN. Se cree que el pulso de calor genera un desequilibrio térmico en la membrana celular, lo que obliga al ADN a entrar en las células a través de los poros celulares o de la pared celular dañada.

La electroporación es otro método para promover la competencia celular. En este método, las células reciben una breve descarga eléctrica de 10-20 kV /cm, que se cree que crea poros en la membrana celular a través de los cuales puede entrar el ADN plasmídico. Tras la descarga eléctrica, los mecanismos de reparación de la membrana celular cierran rápidamente estos poros.

Levadura

La mayoría de las especies de levadura , incluyendo Saccharomyces cerevisiae , pueden transformarse mediante ADN exógeno del ambiente. Se han desarrollado varios métodos para facilitar esta transformación con alta frecuencia en el laboratorio. [ 46 ]

  • Las células de levadura pueden ser tratadas con enzimas para degradar sus paredes celulares, produciendo esferoplastos . Estas células son muy frágiles, pero absorben ADN extraño a una velocidad elevada. [ 47 ]
  • La exposición de células de levadura intactas a cationes alcalinos como el cesio o el litio permite que las células absorban ADN plasmídico. [ 48 ] Protocolos posteriores adaptaron este método de transformación, utilizando acetato de litio , polietilenglicol y ADN monocatenario. [ 49 ] En estos protocolos, el ADN monocatenario se une preferentemente a la pared celular de la levadura, impidiendo que el ADN plasmídico lo haga y dejándolo disponible para la transformación. [ 50 ]
  • Electroporación : Formación de orificios transitorios en las membranas celulares mediante descargas eléctricas; esto permite la entrada de ADN como se describió anteriormente para las bacterias. [ 51 ]
  • También se puede utilizar la digestión enzimática [ 52 ] o la agitación con perlas de vidrio [ 53 ] para transformar células de levadura.

Eficiencia : Los distintos géneros y especies de levadura incorporan ADN extraño con diferentes eficiencias. [ 54 ] Además, la mayoría de los protocolos de transformación se han desarrollado para la levadura de panadería, S. cerevisiae , por lo que podrían no ser óptimos para otras especies. Incluso dentro de una misma especie, las distintas cepas presentan diferentes eficiencias de transformación, a veces con diferencias de hasta tres órdenes de magnitud. Por ejemplo, cuando las cepas de S. cerevisiae se transformaron con 10  µg del plásmido YEp13, la cepa DKD-5D-H produjo entre 550 y 3115 colonias, mientras que la cepa OS1 produjo menos de cinco colonias. [ 55 ]

Plantas

Existen varios métodos para transferir ADN a células vegetales. Algunos métodos mediados por vectores son:

  • La transformación mediada por Agrobacterium es la transformación vegetal más fácil y sencilla. El tejido vegetal (a menudo hojas) se corta en pequeños trozos, por ejemplo, de 10x10 mm, y se sumerge durante diez minutos en un líquido que contiene Agrobacterium en suspensión . Las bacterias se adhieren a muchas de las células vegetales expuestas por el corte. Las células vegetales secretan compuestos fenólicos relacionados con la herida que, a su vez, regulan positivamente el operón de virulencia de Agrobacterium . El operón de virulencia incluye muchos genes que codifican proteínas que forman parte de un sistema de secreción de tipo IV que exporta desde la bacteria proteínas y ADN (delimitado por motivos de reconocimiento específicos llamados secuencias de borde y escindido como una sola hebra del plásmido de virulencia) a la célula vegetal a través de una estructura llamada pilus. El ADN transferido (denominado T-ADN) es guiado al núcleo de la célula vegetal mediante señales de localización nuclear presentes en la proteína VirD2 de Agrobacterium, que se une covalentemente al extremo del T-ADN en el borde derecho (RB). La forma exacta en que el T-ADN se integra en el ADN genómico de la planta huésped es un área activa de investigación en biología vegetal. Suponiendo que se haya incluido un marcador de selección (como un gen de resistencia a antibióticos) en el T-ADN, el tejido vegetal transformado puede cultivarse en medios selectivos para producir brotes. Estos brotes se transfieren a un medio diferente para promover la formación de raíces. Una vez que las raíces comienzan a crecer a partir del brote transgénico, las plantas pueden trasplantarse a tierra para completar un ciclo de vida normal (producir semillas). Las semillas de esta primera planta (denominada T1, por primera generación transgénica) pueden plantarse en un medio selectivo (que contiene un antibiótico) o, si se utilizó un gen de resistencia a herbicidas , pueden plantarse en tierra y posteriormente tratarse con herbicida para eliminar los segregantes de tipo silvestre.

    Algunas especies de plantas, como Arabidopsis thaliana, pueden transformarse sumergiendo las flores o la planta entera en una suspensión de Agrobacterium , generalmente la cepa C58 (C=Cerezo, 58=1958, año en que esta cepa particular de A. tumefaciens [ a ] fue aislada de un cerezo en un huerto de la Universidad de Cornell en Ithaca, Nueva York). Si bien muchas plantas siguen siendo resistentes a la transformación mediante este método, la investigación continúa ampliando la lista de especies que se han modificado con éxito de esta manera.

  • Transformación viral ( transducción ): Consiste en introducir el material genético deseado en un virus vegetal adecuado y permitir que este virus modificado infecte la planta. Si el material genético es ADN, puede recombinarse con los cromosomas para producir células transformantes. Sin embargo, los genomas de la mayoría de los virus vegetales están compuestos de ARN monocatenario que se replica en el citoplasma de la célula infectada. Para estos genomas, este método es una forma de transfección y no una transformación real, ya que los genes insertados nunca llegan al núcleo celular ni se integran en el genoma del huésped. La descendencia de las plantas infectadas está libre del virus y también del gen insertado.

Algunos métodos sin vectores incluyen:

  • Pistola genética : También conocida como bombardeo de partículas, bombardeo de microproyectiles o biobalística. Partículas de oro o tungsteno recubiertas de ADN se disparan contra células vegetales jóvenes o embriones. Parte del material genético permanece en las células y las transforma. Este método también permite la transformación de plastidios vegetales. La eficiencia de la transformación es menor que en la transformación mediada por Agrobacterium , pero la mayoría de las plantas pueden transformarse con este método.
  • Electroporación : Formación de orificios transitorios en las membranas celulares mediante pulsos eléctricos de alta intensidad de campo; esto permite la entrada de ADN como se describió anteriormente para las bacterias. [ 57 ]

Hongos

Existen diversos métodos para producir hongos transgénicos , la mayoría de ellos análogos a los utilizados para las plantas. Sin embargo, los hongos deben tratarse de manera diferente debido a algunas de sus características microscópicas y bioquímicas:

  • Un problema importante es el estado dicariótico en el que se encuentran algunas partes de ciertos hongos; las células dicarióticas contienen dos núcleos haploides, uno de cada hongo progenitor. Si solo uno de ellos se transforma, que es lo habitual, el porcentaje de núcleos transformados disminuye después de cada esporulación . [ 58 ]
  • Las paredes celulares de los hongos son bastante gruesas, lo que dificulta la absorción de ADN, por lo que a menudo se requiere su eliminación (parcial); [ 59 ] la degradación completa, que a veces es necesaria, [ 58 ] produce protoplastos .
  • Los hongos miceliales están formados por hifas filamentosas , que, en su caso, están separadas por paredes celulares internas interrumpidas por poros lo suficientemente grandes como para permitir el paso de nutrientes y orgánulos, a veces incluso núcleos, a través de cada hifa. Como resultado, las células individuales generalmente no se pueden separar. Esto es problemático, ya que las células transformadas vecinas pueden hacer que las no transformadas sean inmunes a los tratamientos de selección, por ejemplo, mediante el suministro de nutrientes o proteínas para la resistencia a los antibióticos. [ 58 ]
  • Además, el crecimiento (y por lo tanto la mitosis) de estos hongos ocurre exclusivamente en la punta de sus hifas, lo que también puede generar problemas. [ 58 ]

Como se mencionó anteriormente, una serie de métodos utilizados para la transformación de plantas también funcionan en hongos:

  • Agrobacterium no solo es capaz de infectar plantas sino también hongos; sin embargo, a diferencia de las plantas, los hongos no secretan los compuestos fenólicos necesarios para activar a Agrobacterium, por lo que estos deben agregarse, por ejemplo, en forma de acetosiringona . [ 58 ]
  • Gracias al desarrollo de un sistema de expresión para ARN pequeños en hongos, se hizo posible la introducción de un sistema CRISPR/Cas9 en células fúngicas. [ 58 ] En 2016, el USDA declaró que no regularía una cepa de champiñón blanco editada con CRISPR/Cas9 para prevenir el pardeamiento del cuerpo fructífero, lo que provocó un amplio debate sobre la comercialización de cultivos editados con CRISPR/Cas9. [ 60 ]
  • Los métodos físicos como la electroporación, la biolística ("pistola genética"), la sonoporación que utiliza la cavitación de burbujas de gas producidas por ultrasonido para penetrar la membrana celular, etc., también son aplicables a los hongos. [ 61 ]

Animales

La introducción de ADN en células animales se suele denominar transfección y se analiza en el artículo correspondiente.

Aspectos prácticos de la transformación en biología molecular

El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en bacterias permite utilizar bacterias como Escherichia coli como huésped idóneo para la manipulación del ADN y la expresión de proteínas. Generalmente, se utilizan plásmidos para la transformación en E. coli . Para que una molécula de ADN plasmídico se mantenga de forma estable en la célula, debe contener un origen de replicación , lo que le permite replicarse independientemente de la replicación del cromosoma celular.

La eficiencia con la que un cultivo competente puede incorporar ADN exógeno y expresar sus genes se conoce como eficiencia de transformación y se mide en unidades formadoras de colonias (UFC) por μg de ADN utilizado. Una eficiencia de transformación de 1 × 10⁸ UFC /μg para un plásmido pequeño como pUC19 equivale aproximadamente a que se transforme 1 de cada 2000 moléculas del plásmido utilizado.

En la transformación con cloruro de calcio , las células se preparan enfriándolas en presencia de Ca 2+.(en CaCl2 solución), haciendo que la célula se vuelva permeable alADN plasmídico. Las células se incuban en hielo con el ADN y luego se someten a un breve choque térmico (por ejemplo, a 42 °C durante 30-120 segundos). Este método funciona muy bien para el ADN plasmídico circular. Las preparaciones no comerciales normalmente deberían dar de 106a 107transformantes por microgramo de plásmido; una preparación deficiente será de aproximadamente 104/μg o menos, pero una buena preparación de células competentes puede dar hasta ~108colonias por microgramo de plásmido. [ 62 ] Sin embargo, existen protocolos para hacer células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación de más de 109. [ 63 ] Sin embargo, el método químico generalmente no funciona bien para el ADN lineal, como los fragmentos de ADN cromosómico, probablemente porqueexonucleasasdegradan rápidamente el ADN lineal. Por el contrario, las células que son naturalmente competentes suelen transformarse de forma más eficiente con ADN lineal que con ADN plasmídico.

La eficiencia de transformación utilizando CaClEl método 2 disminuye con el tamaño del plásmido, por lo que la electroporación puede ser un método más eficaz para la captación de ADN plasmídico grande. [ 64 ] Las células utilizadas en la electroporación deben prepararse primero lavándolas en agua bidestilada fría para eliminar las partículas cargadas que pueden crear chispas durante el proceso de electroporación.

Selección y cribado en la transformación de plásmidos

Debido a que la transformación generalmente produce una mezcla de relativamente pocas células transformadas y una abundancia de células no transformadas, es necesario un método para seleccionar las células que han adquirido el plásmido. [ 65 ] Por lo tanto, el plásmido requiere un marcador seleccionable de manera que las células sin el plásmido puedan ser eliminadas o su crecimiento detenido. La resistencia a los antibióticos es el marcador más comúnmente utilizado para procariotas. El plásmido transformante contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico al que las bacterias son sensibles de otro modo. La mezcla de células tratadas se cultiva en medios que contienen el antibiótico de manera que solo las células transformadas puedan crecer. Otro método de selección es el uso de ciertos marcadores auxotróficos que pueden compensar la incapacidad de metabolizar ciertos aminoácidos, nucleótidos o azúcares. Este método requiere el uso de cepas mutadas adecuadas que sean deficientes en la síntesis o utilidad de una biomolécula particular, y las células transformadas se cultivan en un medio que permite el crecimiento únicamente de las células que contienen el plásmido.

En un experimento de clonación, se puede insertar un gen en un plásmido utilizado para la transformación. Sin embargo, en este tipo de experimentos, no todos los plásmidos contienen el gen insertado correctamente. Por lo tanto, se pueden emplear técnicas adicionales para seleccionar las células transformadas que contienen el plásmido con el inserto. Se pueden usar genes reporteros como marcadores , como el gen lacZ , que codifica la β-galactosidasa y se utiliza en el cribado azul-blanco . Este método de cribado se basa en el principio de α- complementación , donde un fragmento del gen lacZ ( lacZα ) en el plásmido puede complementar otro gen lacZ mutante ( lacZΔM15 ) en la célula. Ambos genes, por sí solos, producen péptidos no funcionales; sin embargo, cuando se expresan juntos, como cuando un plásmido que contiene lacZ-α se transforma en células lacZΔM15 , forman una β-galactosidasa funcional. La presencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse cuando las células se cultivan en placas que contienen X-gal , formando colonias azules características. Sin embargo, el sitio de clonación múltiple , donde se puede ligar un gen de interés al vector plasmídico , se encuentra dentro del gen lacZα . Por lo tanto, una ligación exitosa interrumpe el gen lacZα , impidiendo la formación de una β-galactosidasa funcional y dando como resultado colonias blancas. Las células que contienen el inserto ligado con éxito pueden identificarse fácilmente por su color blanco, diferenciándolas de las células azules en las que la ligación no fue exitosa.

Otros genes reporteros comúnmente utilizados son la proteína verde fluorescente (GFP), que produce células que brillan en verde bajo luz azul, y la enzima luciferasa , que cataliza una reacción con la luciferina para emitir luz. El ADN recombinante también puede detectarse mediante otros métodos, como la hibridación de ácidos nucleicos con una sonda de ARN radiactiva, mientras que las células que expresan la proteína deseada a partir del plásmido pueden detectarse mediante métodos inmunológicos.

Referencias

  1. ↑ Los genomas secuenciados de la cepa C58 no son suficientemente similares a la cepa tipo (ni a la antigua B6 ni a la nueva A1) de Agrobacterium tumefaciens como para ser considerados la misma especie. El nombre " Agrobacterium fabrum " (Lassalle et al., 2011) fue propuesto para incluir esta cepa, pero no fue validado. [ 56 ]
  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP (marzo de 2014). "Transformación bacteriana: distribución, mecanismos compartidos y control divergente". Nature Reviews. Microbiology . 12 (3): 181– 96. doi : 10.1038/nrmicro3199 . PMID 24509783. S2CID 23559881 .  
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