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transferencia de energía por resonancia de Förster

Diagrama de Jablonski de FRET con escalas de tiempo típicas indicadas. La línea discontinua negra indica un fotón virtual . La transferencia de energía por resonancia de Förster...

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Diagrama de Jablonski de FRET con escalas de tiempo típicas indicadas. La línea discontinua negra indica un fotón virtual .

La transferencia de energía por resonancia de Förster ( FRET ), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia , transferencia de energía por resonancia ( RET ) o transferencia de energía electrónica ( EET ) es un mecanismo que describe la transferencia de energía entre dos moléculas fotosensibles ( cromóforos ). [ 1 ] Un cromóforo donador, inicialmente en su estado excitado electrónico , puede transferir energía a un cromóforo aceptor mediante acoplamiento dipolo-dipolo no radiativo . [ 2 ] La eficiencia de esta transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donador y el aceptor, lo que hace que la FRET sea extremadamente sensible a pequeños cambios en la distancia. [ 3 ] [ 4 ]

Las mediciones de la eficiencia FRET se pueden utilizar para determinar si dos fluoróforos se encuentran a una cierta distancia entre sí. [ 5 ] Dichas mediciones se utilizan como herramienta de investigación en campos como la biología y la química.

La transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) es análoga a la comunicación de campo cercano , ya que el radio de interacción es mucho menor que la longitud de onda de la luz emitida. En la región de campo cercano, el cromóforo excitado emite un fotón virtual que es absorbido instantáneamente por un cromóforo receptor. Estos fotones virtuales son indetectables, puesto que su existencia viola la conservación de la energía y el momento, por lo que la FRET se conoce como un mecanismo sin radiación . Se han utilizado cálculos electrodinámicos cuánticos para determinar que la FRET sin radiación y la transferencia de energía radiativa son las asíntotas de corto y largo alcance de un único mecanismo unificado. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]

Terminología

Diagrama esquemático del concepto de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET).

La transferencia de energía por resonancia de Förster recibe su nombre del científico alemán Theodor Förster . [ 9 ] Cuando ambos cromóforos son fluorescentes, a menudo se utiliza el término "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia", aunque la energía no se transfiere realmente por fluorescencia . [ 10 ] [ 11 ] Para evitar una interpretación errónea del fenómeno, que siempre es una transferencia de energía no radiativa (incluso cuando ocurre entre dos cromóforos fluorescentes), se prefiere el nombre "transferencia de energía por resonancia de Förster" a "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia"; sin embargo, este último es de uso común en la literatura científica. [ 12 ] La FRET no se limita a la fluorescencia y también ocurre en relación con la fosforescencia . [ 10 ]

Fundamento teórico

La eficiencia FRET (mi{\displaystyle E}) es el rendimiento cuántico de la transición de transferencia de energía, es decir, la probabilidad de que ocurra un evento de transferencia de energía por cada evento de excitación del donante: [ 13 ]

mi=kETkF+kET+∑ki,{\displaystyle E={\frac {k_{\text{ET}}}{k_{f}+k_{\text{ET}}+\sum {k_{i}}}},}

dóndekF{\displaystyle k_{f}}la tasa de desintegración radiactiva del donante,kET{\displaystyle k_{\text{ET}}}es la tasa de transferencia de energía, yki{\displaystyle k_{i}}las tasas de cualquier otra vía de desexcitación excluyendo las transferencias de energía a otros aceptores. [ 14 ] [ 15 ]

La eficiencia FRET depende de muchos parámetros físicos [ 16 ] que se pueden agrupar como: 1) la distancia entre el donante y el aceptor (típicamente en el rango de 1 a 10  nm), 2) la superposición espectral del espectro de emisión del donante y el espectro de absorción del aceptor , y 3) la orientación relativa del momento dipolar de emisión del donante y el momento dipolar de absorción del aceptor.

mi{\displaystyle E}depende de la distancia de separación entre el donante y el aceptorr{\displaystyle r}con una ley de sexta potencia inversa debido al mecanismo de acoplamiento dipolo-dipolo:

mi=11+(r/R0)6{\displaystyle E={\frac {1}{1+(r/R_{0})^{6}}}}

conR0{\displaystyle R_{0}}siendo la distancia de Förster de este par donador y aceptor, es decir, la distancia a la que la eficiencia de transferencia de energía es del 50%. [ 14 ] La distancia de Förster depende de la integral de solapamiento del espectro de emisión del donador con el espectro de absorción del aceptor y su orientación molecular mutua como se expresa en la siguiente ecuación, todo en unidades del SI: [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]

R06=2.07128π5norteAκ2QDnorte4∫FD(λ)ϵA(λ)λ4dλ{\displaystyle {R_{0}}^{6}={\frac {2.07}{128\,\pi ^{5}\,N_{A}}}\,{\frac {\kappa ^{2}\,Q_{D}}{n^{4}}}{\int F_{\rm {D}}(\lambda )\,\epsilon _{\rm {A}}(\lambda )\,\lambda ^{4}\,d\lambda }}

dóndeQD{\displaystyle Q_{\text{D}}}es el rendimiento cuántico de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor,κ2{\displaystyle \kappa ^{2}}es el factor de orientación del dipolo,norte{\displaystyle n}es el índice de refracción del medio,norteA{\displaystyle N_{\text{A}}}es la constante de Avogadro yJ{\displaystyle J}es la integral de superposición espectral calculada como

J=∫FD(λ)ϵA(λ)λ4dλ∫FD(λ)dλ=∫FD¯(λ)ϵA(λ)λ4dλ,{\displaystyle J={\frac {\int f_{\text{D}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda }{\int f_{\text{D}}(\lambda )\,d\lambda }}=\int {\overline {f_{\text{D}}}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda ,}

dóndeFD{\displaystyle f_{\text{D}}}es el espectro de emisión del donante,FD¯{\displaystyle {\overline {f_{\text{D}}}}}es el espectro de emisión del donante normalizado a un área de 1, yϵA{\displaystyle \epsilon _{\text{A}}}es el coeficiente de extinción molar del aceptor , normalmente obtenido a partir de un espectro de absorción. [ 20 ] El factor de orientación κ viene dado por

κ=μ^A⋅μ^D−3(μ^D⋅R^)(μ^A⋅R^),{\displaystyle \kappa ={\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {\mu }}_{\text{D}}-3({\hat {\mu }}_{\text{D}}\cdot {\hat {R}})({\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {R}}),}

dóndeμ^i{\displaystyle {\sombrero {\mu }}_{i}}denota el momento dipolar de transición normalizado del fluoróforo respectivo, yR^{\displaystyle {\hat {R}}}denota el desplazamiento interfluoróforo normalizado. [ 21 ]κ2{\displaystyle \kappa ^{2}}A menudo se asume que = 2/3. Este valor se obtiene cuando ambos colorantes giran libremente y se puede considerar que están orientados isotrópicamente durante la vida útil del estado excitado. Si alguno de los colorantes está fijo o no puede girar libremente, entoncesκ2{\displaystyle \kappa ^{2}}= 2/3 no será una suposición válida. Sin embargo, en la mayoría de los casos, incluso una modesta reorientación de los tintes produce un promedio de orientación suficiente como para queκ2{\displaystyle \kappa ^{2}}= 2/3 no produce un gran error en la distancia estimada de transferencia de energía debido a la dependencia de la sexta potencia deR0{\displaystyle R_{0}}enκ2{\displaystyle \kappa ^{2}}Incluso cuandoκ2{\displaystyle \kappa ^{2}}es bastante diferente de 2/3, el error puede asociarse con un cambio enR0{\displaystyle R_{0}}y, por lo tanto, las determinaciones de cambios en la distancia relativa para un sistema particular siguen siendo válidas. Las proteínas fluorescentes no se reorientan en una escala de tiempo más rápida que su tiempo de vida de fluorescencia. En este caso, 0 ≤κ2{\displaystyle \kappa ^{2}}≤ 4. [ 20 ]

Las unidades de los datos generalmente no están en unidades del SI. Usar las unidades originales para calcular la distancia de Förster suele ser más conveniente. Por ejemplo, la longitud de onda a menudo está en unidades nm y el coeficiente de extinción a menudo está en unidadesMETRO−1dometro−1{\displaystyle M^{-1}cm^{-1}}, dóndeMETRO{\displaystyle M}es concentraciónmetrool/L{\displaystyle mol/L}.J{\displaystyle J}obtenido de estas unidades tendrá unidadMETRO−1dometro−1nortemetro4{\displaystyle M^{-1}cm^{-1}nm^{4}}. Para usar la unidad Å (10−10metro{\displaystyle 10^{-10}m}) para elR0{\displaystyle R_{0}}, la ecuación se ajusta a [ 17 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ]

R06=8.785×10−5κ2QDnorte4J{\displaystyle {R_{0}}^{6}=8.785\times 10^{-5}{\frac {\kappa ^{2}\,Q_{D}}{n^{4}}}J} (A6{\displaystyle ^{6}})

Para análisis dependientes del tiempo de FRET, la tasa de transferencia de energía (kET{\displaystyle k_{\text{ET}}}) se puede utilizar directamente en su lugar: [ 17 ]

kET=(R0r)61τD{\displaystyle k_{\text{ET}}=\left({\frac {R_{0}}{r}}\right)^{6}\,{\frac {1}{\tau _{D}}}}

dóndeτD{\displaystyle \tau _{D}}es el tiempo de vida de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor.

La eficiencia FRET se relaciona con el rendimiento cuántico y la vida útil de fluorescencia de la molécula donante de la siguiente manera: [ 25 ]

mi=1−τD′/τD,{\displaystyle E=1-\tau '_{\text{D}}/\tau _{\text{D}},}

dóndeτD′{\displaystyle \tau _{\text{D}}'}yτD{\displaystyle \tau _{\text{D}}}son los tiempos de vida de fluorescencia del donante en presencia y ausencia de un aceptor respectivamente, o como

mi=1−FD′/FD,{\displaystyle E=1-F_{\text{D}}'/F_{\text{D}},}

dóndeFD′{\displaystyle F_{\text{D}}'}yFD{\displaystyle F_{\text{D}}}son las intensidades de fluorescencia del donante con y sin un aceptor respectivamente.

Confirmación experimental de la teoría FRET.

La dependencia de la transferencia de energía de resonancia de Förster con la distancia de sexta potencia inversa fue confirmada experimentalmente por Wilchek , Edelhoch y Brand [ 26 ] utilizando péptidos de triptófano. Stryer , Haugland y Yguerabide [ 27 ] [ 28 ] también demostraron experimentalmente la dependencia teórica de la transferencia de energía de resonancia de Förster con la integral de solapamiento utilizando un indolosteroide fusionado como donador y una cetona como aceptor. Los cálculos sobre las distancias FRET de algunos pares de colorantes de ejemplo se pueden encontrar aquí. [ 22 ] [ 24 ] Sin embargo, se observaron muchas contradicciones entre los experimentos especiales y la teoría en entornos complejos cuando las orientaciones y los rendimientos cuánticos de las moléculas son difíciles de estimar. [ 29 ]

Métodos para medir la eficiencia de FRET

En microscopía de fluorescencia , microscopía confocal de barrido láser de fluorescencia , así como en biología molecular , FRET es una herramienta útil para cuantificar la dinámica molecular en biofísica y bioquímica , como las interacciones proteína -proteína, proteína- ADN , ADN-ADN, [ 30 ] y los cambios conformacionales de las proteínas. Para monitorizar la formación de complejos entre dos moléculas, una de ellas se marca con un donante y la otra con un aceptor. Se mide la eficiencia de FRET y se utiliza para identificar las interacciones entre los complejos marcados. Existen varias formas de medir la eficiencia de FRET monitorizando los cambios en la fluorescencia emitida por el donante o el aceptor. [ 31 ]

Emisión sensibilizada

Un método para medir la eficiencia de FRET consiste en medir la variación en la intensidad de emisión del aceptor. [ 18 ] Cuando el donador y el aceptor se encuentran próximos (1–10  nm) debido a la interacción de las dos moléculas, la emisión del aceptor aumenta debido a la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) intermolecular del donador al aceptor. Para monitorizar los cambios conformacionales de las proteínas, la proteína diana se marca con un donador y un aceptor en dos sitios. Cuando una torsión o flexión de la proteína produce un cambio en la distancia o la orientación relativa del donador y el aceptor, se observa un cambio de FRET. Si una interacción molecular o un cambio conformacional de la proteína depende de la unión del ligando , esta técnica de FRET es aplicable a indicadores fluorescentes para la detección del ligando.

Fotoblanqueo FRET

Las eficiencias de FRET también pueden inferirse a partir de las tasas de fotoblanqueo del donante en presencia y ausencia de un aceptor. [ 18 ] Este método puede realizarse en la mayoría de los microscopios de fluorescencia; simplemente se ilumina con luz de excitación (de una frecuencia que excitará al donante pero no al aceptor de manera significativa) muestras con y sin el fluoróforo aceptor y se monitoriza la fluorescencia del donante (normalmente separada de la fluorescencia del aceptor mediante un filtro de paso de banda ) a lo largo del tiempo. La escala de tiempo es la del fotoblanqueo, que va de segundos a minutos, y la fluorescencia en cada curva viene dada por

fondo+constante⋅mi−tiempo/τpb,{\displaystyle {\text{background}}+{\text{constant}}\cdot e^{-{\text{time}}/\tau _{\text{pb}}},}

dóndeτpb{\displaystyle \tau _{\text{pb}}}es la constante de tiempo de decaimiento del fotoblanqueo y depende de si el aceptor está presente o no. Dado que el fotoblanqueo consiste en la inactivación permanente de fluoróforos excitados, la transferencia de energía por resonancia de un donante excitado a un fluoróforo aceptor impide el fotoblanqueo de ese fluoróforo donante, y por lo tanto, una alta eficiencia FRET conduce a una constante de tiempo de decaimiento del fotoblanqueo más larga:

mi=1−τpb/τpb′,{\displaystyle E=1-\tau _{\text{pb}}/\tau _{\text{pb}}',}

dóndeτpb′{\displaystyle \tau _{\text{pb}}'}yτpb{\displaystyle \tau _{\text{pb}}}son las constantes de tiempo de decaimiento del fotoblanqueo del donante en presencia y en ausencia del aceptor, respectivamente. (Nótese que la fracción es la recíproca de la utilizada para las mediciones de tiempo de vida).

Esta técnica fue introducida por Jovin en 1989. [ 32 ] Su uso de una curva completa de puntos para extraer las constantes de tiempo puede brindarle ventajas de precisión sobre otros métodos. Además, el hecho de que las mediciones de tiempo sean en segundos en lugar de nanosegundos la hace más sencilla que las mediciones de tiempo de vida de fluorescencia, y debido a que las tasas de decaimiento de fotoblanqueo generalmente no dependen de la concentración del donante (a menos que la saturación del aceptor sea un problema), no se requiere el control cuidadoso de las concentraciones necesario para las mediciones de intensidad. Sin embargo, es importante mantener la misma iluminación para las mediciones con y sin aceptor, ya que el fotoblanqueo aumenta notablemente con una luz incidente más intensa.

Mediciones de vida útil

La eficiencia de FRET también puede determinarse a partir del cambio en el tiempo de vida de fluorescencia del donante. [ 18 ] El tiempo de vida del donante disminuirá en presencia del aceptor. Las mediciones del tiempo de vida del FRET-donante se utilizan en la microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM).

FRET de molécula única (smFRET)

smFRET es un conjunto de métodos que utilizan diversas técnicas microscópicas para medir un par de fluoróforos donador y aceptor, los cuales se excitan y detectan a nivel de molécula individual. A diferencia de "ensemble FRET" o "bulk FRET", que proporciona la señal FRET de un gran número de moléculas, smFRET permite resolver la señal FRET de cada molécula individual. La variación de la señal smFRET es útil para revelar información cinética que una medición de conjunto no puede proporcionar, especialmente cuando el sistema se encuentra en equilibrio. También se puede observar la heterogeneidad entre diferentes moléculas. Este método se ha aplicado en numerosas mediciones de dinámica biomolecular, como el plegamiento/desplegamiento de ADN/ARN/proteínas y otros cambios conformacionales, así como en dinámica intermolecular, como la reacción, la unión, la adsorción y la desorción , particularmente útiles en la detección química, los bioensayos y la biodetección.

Fluoróforos utilizados para FRET

Si el enlazador está intacto, la excitación a la longitud de onda de absorbancia de CFP (414  nm) provoca la emisión de YFP (525  nm) debido a FRET. Si el enlazador es escindido por una proteasa, se anula FRET y la emisión se produce a la longitud de onda de CFP (475  nm).

Pares CFP-YFP

Un par común de fluoróforos para uso biológico es el de la proteína fluorescente cian (CFP) y la proteína fluorescente amarilla (YFP). [ 33 ] Ambas son variantes de color de la proteína fluorescente verde (GFP). El marcaje con colorantes fluorescentes orgánicos requiere purificación, modificación química e inyección intracelular de una proteína huésped. Las variantes de GFP pueden unirse a una proteína huésped mediante ingeniería genética, lo que puede resultar más conveniente. Además, una fusión de CFP y YFP ("dímero en tándem") unida por una secuencia de escisión de proteasa puede utilizarse como ensayo de escisión. [ 34 ]

BRET

Una limitación de FRET realizada con donantes de fluoróforos es el requisito de iluminación externa para iniciar la transferencia de fluorescencia, lo que puede generar ruido de fondo en los resultados debido a la excitación directa del aceptor o al fotoblanqueo . Para evitar este inconveniente, se ha desarrollado la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (o BRET). [ 35 ] [ 36 ] Esta técnica utiliza una luciferasa bioluminiscente (típicamente la luciferasa de Renilla reniformis ) en lugar de CFP para producir una emisión de fotones inicial compatible con YFP.

BRET también se ha implementado utilizando una enzima luciferasa diferente , modificada genéticamente a partir del camarón de aguas profundas Oplophorus gracilirostris . Esta luciferasa es más pequeña (19 kD) y más brillante que la luciferasa más comúnmente utilizada de Renilla reniformis , [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] y ha sido denominada NanoLuc [ 41 ] o NanoKAZ. [ 42 ] Promega ha desarrollado un sustrato patentado para NanoLuc llamado furimazina, [ 43 ] [ 41 ] aunque también se han publicado otros valiosos sustratos de coelenterazina para NanoLuc. [ 42 ] [ 44 ] Una versión de proteína dividida de NanoLuc desarrollada por Promega [ 45 ] también se ha utilizado como donante BRET en experimentos que miden interacciones proteína-proteína. [ 46 ]

Homo-FRET

En general, "FRET" se refiere a situaciones en las que las proteínas donadoras y aceptoras (o "fluoróforos") son de dos tipos diferentes. Sin embargo, en muchas situaciones biológicas, los investigadores podrían necesitar examinar las interacciones entre dos o más proteínas del mismo tipo, o incluso la misma proteína consigo misma, por ejemplo, si la proteína se pliega o forma parte de una cadena polimérica de proteínas [ 47 ] o para otras cuestiones de cuantificación en células biológicas [ 48 ] o experimentos in vitro [ 49 ] .

Obviamente, las diferencias en los espectros UV-Vis convencionales no serán la herramienta utilizada para detectar y medir FRET homogéneo, ya que tanto el aceptor como el donador emiten luz con las mismas longitudes de onda. Sin embargo, hay evidencia de que ciertas espectroscopías no lineales pueden proporcionar señales de FRET homogéneo que serían invisibles en los espectros lineales. [ 50 ] Aun así, los investigadores pueden detectar diferencias en la polarización entre la luz que excita los fluoróforos y la luz que se emite, en una técnica llamada imagen de anisotropía FRET; el nivel de anisotropía cuantificada (diferencia en la polarización entre los haces de excitación y emisión) se convierte entonces en una guía indicativa de cuántos eventos FRET han ocurrido. [ 51 ]

En el campo de la nanofotónica, la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) puede ser perjudicial si canaliza la energía excitónica hacia sitios defectuosos, pero también es esencial para la recolección de carga en células solares orgánicas y sensibilizadas con puntos cuánticos, y se han propuesto diversas estrategias habilitadas por FRET para diferentes dispositivos optoelectrónicos. Por lo tanto, es esencial comprender cómo se comportan los nanoemisores aislados cuando se apilan en una capa densa. Las nanoplaquetas son candidatas especialmente prometedoras para la fuerte difusión de excitones homo-FRET debido a su fuerte acoplamiento dipolar en el plano y bajo desplazamiento de Stokes . [ 52 ] El estudio de microscopía de fluorescencia de tales cadenas individuales demostró que la transferencia de energía por FRET entre plaquetas vecinas hace que la energía se difunda a lo largo de una longitud típica de 500 nm (aproximadamente 80 nanoemisores), y el tiempo de transferencia entre plaquetas es del orden de 1 ps. [ 53 ]

Otros

Varios compuestos además de las proteínas fluorescentes. [ 54 ]

Aplicaciones

Las aplicaciones de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se han expandido enormemente en los últimos 25 años, y la técnica se ha convertido en un elemento fundamental en muchos campos biológicos y biofísicos . La FRET puede utilizarse como una regla espectroscópica para medir distancias y detectar interacciones moleculares en diversos sistemas, y tiene aplicaciones en biología y bioquímica. [ 28 ] [ 55 ]

Proteínas

FRET se usa frecuentemente para detectar y rastrear interacciones entre proteínas. [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ] Además, FRET puede usarse para medir distancias entre dominios en una sola proteína al marcar diferentes regiones de la proteína con fluoróforos y medir la emisión para determinar la distancia. Esto proporciona información sobre la conformación de la proteína , incluyendo estructuras secundarias y plegamiento de proteínas . [ 60 ] [ 61 ] Esto se extiende al seguimiento de cambios funcionales en la estructura de la proteína, como cambios conformacionales asociados con la actividad de la miosina . [ 62 ] Aplicado in vivo, FRET se ha usado para detectar la ubicación e interacciones de estructuras celulares incluyendo integrinas y proteínas de membrana . [ 63 ]

Membranas

La FRET se puede utilizar para observar la fluidez de la membrana , el movimiento y la dispersión de las proteínas de membrana, las interacciones lípido-proteína y proteína-proteína de la membrana, y la mezcla exitosa de diferentes membranas. [ 64 ] La FRET también se utiliza para estudiar la formación y las propiedades de los dominios de membrana y las balsas lipídicas en las membranas celulares [ 65 ] y para determinar la densidad superficial en las membranas. [ 66 ]

Quimiosensor

Sonda basada en FRET que se activa al interactuar con Cd2+

Las sondas basadas en FRET pueden detectar la presencia de diversas moléculas: la estructura de la sonda se ve afectada por la unión o actividad de moléculas pequeñas, lo que puede activar o desactivar el sistema FRET. Esto se utiliza a menudo para detectar aniones, cationes, moléculas pequeñas sin carga y también algunas biomacromoléculas más grandes. De manera similar, se han diseñado sistemas FRET para detectar cambios en el entorno celular debido a factores como el pH , la hipoxia o el potencial de membrana mitocondrial . [ 67 ]

Vías de señalización

Otro uso de FRET es en el estudio de vías metabólicas o de señalización . [ 68 ] Por ejemplo, FRET y BRET se han utilizado en varios experimentos para caracterizar la activación de receptores acoplados a proteínas G y los consiguientes mecanismos de señalización. [ 69 ] Otros ejemplos incluyen el uso de FRET para analizar procesos tan diversos como la quimiotaxis bacteriana [ 70 ] y la actividad de la caspasa en la apoptosis . [ 71 ]

Cinética del plegamiento de proteínas y nucleótidos

La dinámica de plegamiento de proteínas, ADN, ARN y otros polímeros se ha estudiado mediante FRET. Generalmente, estos sistemas se encuentran en equilibrio, cuya cinética permanece oculta. Sin embargo, es posible medirla mediante FRET de molécula única, con la correcta colocación de los colorantes aceptor y donador en las moléculas. Consulte FRET de molécula única para obtener una descripción más detallada.

Otras aplicaciones

Además de los usos comunes mencionados anteriormente, FRET y BRET también son eficaces en el estudio de la cinética de reacciones bioquímicas. [ 72 ] FRET se utiliza cada vez más para monitorizar el ensamblaje y desensamblaje dependiente del pH y es valioso en el análisis de la encapsulación de ácidos nucleicos . [ 73 ] [ 74 ] [ 75 ] [ 76 ] Esta técnica puede utilizarse para determinar los factores que afectan a diversos tipos de formación de nanopartículas [ 77 ] [ 78 ] así como los mecanismos y efectos de las nanomedicinas . [ 79 ]

Otros métodos

Otro mecanismo diferente, pero relacionado, es la transferencia de electrones de Dexter .

Un método alternativo para detectar la proximidad entre proteínas es la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), en la que dos partes de una proteína fluorescente se fusionan con otras proteínas. Cuando estas dos partes se encuentran, forman un fluoróforo en una escala de tiempo de minutos u horas. [ 80 ]

Véase también

Referencias

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