Fluorescence microscope

A fluorescence microscope is an optical microscope that uses fluorescence instead of, or in addition to scattering, reflection, and attenuation or absorption, to study the properties of organic or inorganic substances.^[1][2] A fluorescence microscope is any microscope that uses fluorescence to generate an image, whether it is a simple setup like an epifluorescence microscope or a more complicated design such as a confocal microscope, which uses optical sectioning to get better resolution of the fluorescence image.^[3]

The specimen is illuminated with light of a specific wavelength (or wavelengths) which is absorbed by the fluorophores, causing them to emit light of longer wavelengths (i.e., of a different color than the absorbed light). The illumination light is separated from the much weaker emitted fluorescence through the use of a spectral emission filter. Typical components of a fluorescence microscope are a light source (xenon arc lamp or mercury-vapor lamp are common; more advanced forms are high-power LEDs and lasers), the excitation filter, the dichroic mirror (or dichroic beamsplitter), and the emission filter (see figure below). The filters and the dichroic beamsplitter are chosen to match the spectral excitation and emission characteristics of the fluorophore used to label the specimen.^[1] In this manner, the distribution of a single fluorophore (color) is imaged at a time. Multi-color images of several types of fluorophores must be composed by combining several single-color images.^[1]

Most fluorescence microscopes in use are epifluorescence microscopes, where excitation of the fluorophore and detection of the fluorescence are done through the same light path (i.e. through the objective). These microscopes are widely used in biology and are the basis for more advanced microscope designs, such as the confocal microscope and the total internal reflection fluorescence microscope (TIRF).

Epifluorescence microscopy

La mayoría de los microscopios de fluorescencia, especialmente los utilizados en ciencias biológicas , son del tipo de epifluorescencia que se muestra en el diagrama. La luz de la longitud de onda de excitación ilumina la muestra a través del objetivo . La fluorescencia emitida por la muestra se enfoca en el detector mediante el mismo objetivo que se utiliza para la excitación, lo que requiere un objetivo con mayor apertura numérica para obtener una mayor resolución . Dado que la mayor parte de la luz de excitación se transmite a través de la muestra, solo la luz excitatoria reflejada llega al objetivo junto con la luz emitida, por lo que el método de epifluorescencia proporciona una alta relación señal-ruido. El divisor de haz dicroico actúa como un filtro específico de longitud de onda, transmitiendo la luz fluorescente al ocular o al detector, pero reflejando la luz de excitación restante de vuelta a la fuente.

La microscopía de fluorescencia requiere una iluminación intensa, casi monocromática, que algunas fuentes de luz comunes, como las lámparas halógenas , no pueden proporcionar. ^{[ 4 ]} Se utilizan cuatro tipos principales de fuentes de luz, incluyendo lámparas de arco de xenón o lámparas de vapor de mercurio con un filtro de excitación , láseres , fuentes de supercontinuo y LED de alta potencia . Los láseres son los más utilizados para técnicas de microscopía de fluorescencia más complejas, como la microscopía confocal y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, mientras que las lámparas de xenón, las lámparas de mercurio y los LED con un filtro de excitación dicroico se utilizan comúnmente para microscopios de epifluorescencia de campo amplio. Al colocar dos matrices de microlentes en la trayectoria de iluminación de un microscopio de epifluorescencia de campo amplio, ^{[ 5 ]} se puede lograr una iluminación altamente uniforme con un coeficiente de variación del 1-2%.

Para que una muestra sea apta para la microscopía de fluorescencia, debe ser fluorescente. Existen varios métodos para crear una muestra fluorescente; las principales técnicas son el marcaje con colorantes fluorescentes o, en el caso de muestras biológicas, la expresión de una proteína fluorescente . Alternativamente, se puede utilizar la fluorescencia intrínseca de la muestra (es decir, la autofluorescencia ). ^{[ 1 ]} En las ciencias de la vida, la microscopía de fluorescencia es una herramienta poderosa que permite la tinción específica y sensible de una muestra para detectar la distribución de proteínas u otras moléculas de interés. Por consiguiente, existe una amplia gama de técnicas para la tinción fluorescente de muestras biológicas.

Los fluoróforos pierden su capacidad de fluorescencia al ser iluminados, en un proceso denominado fotoblanqueo . Este se produce cuando las moléculas fluorescentes acumulan daños químicos debido a los electrones excitados durante la fluorescencia. El fotoblanqueo puede limitar considerablemente el tiempo de observación de una muestra mediante microscopía de fluorescencia. Existen diversas técnicas para reducir el fotoblanqueo, como el uso de fluoróforos más resistentes, la minimización de la iluminación o el uso de agentes fotoprotectores .

La microscopía de fluorescencia con proteínas fluorescentes reporteras ha permitido el análisis de células vivas; sin embargo, las células son susceptibles a la fototoxicidad, especialmente con luz de longitud de onda corta. Además, las moléculas fluorescentes tienden a generar especies químicas reactivas al ser iluminadas, lo que intensifica el efecto fototóxico.

A diferencia de las técnicas de microscopía de luz transmitida y reflejada, la microscopía de fluorescencia solo permite observar las estructuras específicas que han sido marcadas con fluorescencia. Por ejemplo, la observación de una muestra de tejido preparada con una tinción fluorescente de ADN mediante microscopía de fluorescencia solo revela la organización del ADN dentro de las células y no muestra nada más sobre la morfología celular.

Las técnicas computacionales que proponen estimar la señal fluorescente a partir de imágenes no fluorescentes (como las de campo claro) pueden reducir estas preocupaciones. ^{[ 9 ]} En general, estos enfoques implican entrenar una red neuronal convolucional profunda con células teñidas y luego estimar la fluorescencia en muestras sin teñir. De esta manera, al separar las células en estudio de las células utilizadas para entrenar la red, la obtención de imágenes se puede realizar más rápidamente y con menor fototoxicidad.

La naturaleza ondulatoria de la luz limita el tamaño del punto al que se puede enfocar debido al límite de difracción . Esta limitación fue descrita en el siglo XIX por Ernst Abbe y "limita la resolución de un microscopio óptico a aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada". La microscopía de fluorescencia es fundamental para muchas técnicas que buscan superar este límite mediante configuraciones ópticas especializadas.

En el siglo XX se inventaron varias mejoras en las técnicas de microscopía que dieron como resultado un aumento de la resolución y el contraste en cierta medida. Sin embargo, no superaron el límite de difracción. En 1978 se desarrollaron las primeras ideas teóricas para romper esta barrera utilizando un microscopio 4Pi como microscopio de fluorescencia de barrido láser confocal donde la luz se enfoca idealmente desde todos los lados hacia un foco común que se utiliza para escanear el objeto mediante excitación punto por punto combinada con detección punto por punto. ^{[ 10 ]} Sin embargo, la primera demostración experimental del microscopio 4Pi tuvo lugar en 1994. ^{[ 11 ]} La microscopía 4Pi maximiza la cantidad de direcciones de enfoque disponibles utilizando dos lentes objetivo opuestas o microscopía de excitación de dos fotones utilizando luz desplazada al rojo y excitación multifotónica.

La microscopía correlativa integrada combina un microscopio de fluorescencia con un microscopio electrónico. Esto permite visualizar la ultraestructura y la información contextual con el microscopio electrónico, utilizando los datos del microscopio de fluorescencia como herramienta de marcaje. ^{[ 12 ]}

La primera técnica que logró una resolución subdifractiva fue la microscopía STED , propuesta en 1994. Este método, al igual que todas las técnicas derivadas del concepto RESOLFT , se basa en una fuerte interacción no lineal entre la luz y las moléculas fluorescentes. Las moléculas se desplazan intensamente entre estados moleculares distinguibles en cada ubicación específica, de modo que la luz se emite en una pequeña fracción del espacio, lo que resulta en una mayor resolución.

También en la década de 1990 se desarrolló otro método de microscopía de superresolución basado en microscopía de campo amplio. Se logró una resolución de tamaño sustancialmente mejorada de nanoestructuras celulares teñidas con un marcador fluorescente mediante el desarrollo de la microscopía de localización SPDM y la iluminación láser estructurada (iluminación modulada espacialmente, SMI). ^{[ 13 ]} La combinación del principio de SPDM con SMI dio como resultado el desarrollo del microscopio Vertico SMI . ^{[ 14 ] [ 15 ]} La detección de moléculas individuales de colorantes fluorescentes normales intermitentes como la proteína verde fluorescente (GFP) se puede lograr utilizando un desarrollo posterior de SPDM, la llamada tecnología SPDMphymod, que permite detectar y contar dos tipos diferentes de moléculas fluorescentes a nivel molecular (esta tecnología se conoce como microscopía de localización de dos colores o 2CLM). ^{[ 16 ]}

Como alternativa, la microscopía de localización fotoactivada podría lograr resultados similares mediante el parpadeo o la conmutación de moléculas individuales, donde la fracción de moléculas fluorescentes es muy pequeña en cada instante. Esta respuesta estocástica de las moléculas a la luz aplicada también corresponde a una interacción altamente no lineal, lo que permite alcanzar una resolución subdifractiva.

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  Proyección en el eje z de una célula de osteosarcoma, teñida con faloidina para visualizar los filamentos de actina. La imagen se obtuvo con un microscopio confocal y la posterior deconvolución se realizó mediante una función de dispersión puntual obtenida experimentalmente.
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  Imágenes de epifluorescencia de los tres componentes de una célula cancerosa humana en división. El ADN se tiñe de azul, una proteína llamada INCENP de verde y los microtúbulos de rojo. Cada fluoróforo se visualiza por separado mediante una combinación diferente de filtros de excitación y emisión, y las imágenes se capturan secuencialmente con una cámara CCD digital , para luego superponerlas y obtener una imagen completa.
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  Células endoteliales al microscopio. Los núcleos están teñidos de azul con DAPI, los microtúbulos están marcados de verde con un anticuerpo unido a FITC y los filamentos de actina están marcados de rojo con faloidina unida a TRITC. Células endoteliales de la arteria pulmonar bovina (BPAE).
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  Microscopía 3D de doble color de superresolución con Her2 y Her3 en células mamarias, colorantes estándar: Alexa 488, Alexa 568. Microscopía LIMON.
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  Núcleo de linfocito humano teñido con DAPI con sondas de centrómero de los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo) hibridadas ( hibridación fluorescente in situ (FISH)).
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  Membrana celular de levadura visualizada mediante proteínas de membrana fusionadas con marcadores fluorescentes RFP y GFP. La exposición a la luz de ambos marcadores produce un color amarillo.
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  Microscopía de superresolución: Detección de una sola molécula de YFP en una célula cancerosa humana. Mediciones de distancia típicas en el  rango de 15 nm realizadas con un microscopio Vertico-SMI/SPDMphymod.
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  Microscopía de superresolución: Microscopía de colocalización (2CLM) con proteínas de fusión GFP y RFP (núcleo de una célula de cáncer óseo). Se detectaron 120.000 moléculas localizadas en un área de campo amplio (470  μm² ⁾ medidas con un microscopio Vertico-SMI/SPDMphymod .
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  Microscopía de fluorescencia de la expresión de ADN en la paladina humana de tipo silvestre y mutante P239S.
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  Imágenes de microscopía de fluorescencia de la patología de los destellos solares en una célula sanguínea que muestran las áreas afectadas en rojo.

• Fluorophores.org , la base de datos de colorantes fluorescentes
• Centro de Recursos de Microscopía. Archivado el 22 de octubre de 2014 en Wayback Machine.
• Animaciones y explicaciones sobre diversos tipos de microscopios, incluidos los microscopios de fluorescencia y confocales (Université Paris Sud).