Electroporación

La electroporación , también conocida como electropermeabilización , es una técnica microbiológica y biotecnológica en la que se aplica un campo eléctrico a las células para aumentar brevemente la permeabilidad de la membrana celular . ^{[ 1 ]} La aplicación de un campo eléctrico de alto voltaje induce una desestabilización temporal de la bicapa lipídica , lo que da lugar a la formación de poros a nanoescala que permiten la entrada o salida de macromoléculas . ^{[ 2 ]}

Este método se emplea ampliamente para introducir moléculas —incluidas moléculas pequeñas , ADN , ARN y proteínas— en las células. La electroporación puede realizarse en células en suspensión utilizando cubetas de electroporación , o directamente en células adherentes in situ dentro de sus recipientes de cultivo. ^{[ 3 ]}

En microbiología, la electroporación se utiliza frecuentemente para la transformación de bacterias o células de levadura , ^{[ 4 ]} a menudo con ADN plasmídico . ^{[ 5 ]} También se utiliza en la transfección de protoplastos vegetales y células de mamíferos . ^{[ 2 ]} Cabe destacar que la electroporación desempeña un papel fundamental en la manipulación ex vivo de células inmunitarias para el desarrollo de terapias basadas en células, como la terapia con células T CAR . ^{[ 6 ] [ 7 ]} Además, se han demostrado con éxito aplicaciones in vivo de la electroporación en diversos tipos de tejido. ^{[ 8 ]}

La electroporación masiva ofrece ventajas sobre otros métodos de administración física, como la microinyección y las técnicas de pistola génica . Sin embargo, se ve limitada por la menor viabilidad celular . Para abordar estos problemas, los investigadores han desarrollado enfoques miniaturizados como la microelectroporación ^{[ 9 ]} y la nanotransfección ^{[ 10 ]} . Estas técnicas utilizan la electroporación mediada por nanocanales para administrar carga molecular a las células de forma más controlada y menos invasiva.

Los métodos alternativos para la administración intracelular incluyen el uso de péptidos penetrantes de células , ^{[ 11 ]} técnicas de compresión celular, ^{[ 12 ]} y transformación química , ^{[ 13 ]} con selección dependiendo del tipo de célula específico y las características de la carga.

La electroporación también se emplea para inducir la fusión celular . ^{[ 14 ]} Una aplicación destacada de la fusión celular es la tecnología de hibridomas , donde los linfocitos B productores de anticuerpos se fusionan con líneas celulares de mieloma inmortales para producir anticuerpos monoclonales . ^{[ 15 ] [ 16 ]}

La electroporación se utiliza ampliamente en entornos de laboratorio debido a su capacidad para lograr altas eficiencias de transformación , particularmente para ADN plasmídico, con rendimientos reportados que se aproximan a 10¹⁰ ^unidades formadoras de colonias por microgramo de ADN. La electroporación es generalmente más costosa que los métodos de transformación química debido al equipo especializado requerido. Esto incluye electroporadores —dispositivos diseñados para generar campos electrostáticos controlados para suspensiones celulares ^{[ 17 ]} — y cubetas de electroporación, que generalmente están construidas de vidrio o plástico y contienen electrodos de aluminio paralelos . ^{[ 18 ] [ 19 ]}

Un protocolo estándar de transformación bacteriana consta de varios pasos. Primero, se preparan células electrocompetentes lavándolas para eliminar los iones que podrían causar arcos eléctricos . A continuación, estas células se mezclan con ADN plasmídico y se transfieren a una cubeta de electroporación. Se aplica un pulso eléctrico de alto voltaje, con parámetros específicos como el voltaje y la duración del pulso adaptados al tipo de célula que se esté utilizando. Tras la electroporación, se añade medio de recuperación y las células se incuban a una temperatura adecuada para permitir su crecimiento. Finalmente, las células se siembran en placas de agar selectivo para evaluar la eficiencia de la transformación. ^{[ 20 ]}

El éxito de la electroporación depende de varios factores, incluyendo la pureza de la solución de ADN plasmídico, ^{[ 21 ]} la concentración de sal y los parámetros de electroporación. ^{[ 22 ]} Las altas concentraciones de sal pueden provocar arcos eléctricos (descargas eléctricas), reduciendo significativamente la viabilidad de las células electroporadas. Por lo tanto, las condiciones de electroporación deben optimizarse para cada tipo de célula a fin de lograr un equilibrio efectivo entre la viabilidad celular y la captación de ADN. ^{[ 23 ]}

Además de las aplicaciones in vitro , la electroporación se emplea in vivo para aumentar la permeabilidad de la membrana celular durante inyecciones y procedimientos quirúrgicos. La eficacia de la electroporación in vivo depende en gran medida de parámetros seleccionados como el voltaje, la duración del pulso y el número de pulsos. Los sistemas nerviosos centrales en desarrollo son particularmente adecuados para la electroporación in vivo , ya que los ventrículos proporcionan una visibilidad clara para las inyecciones de ácidos nucleicos y las células en división presentan una mayor permeabilidad . La electroporación de embriones inyectados en el útero se realiza a través de la pared uterina , a menudo utilizando electrodos tipo fórceps para minimizar el daño embrionario. ^{[ 24 ]}

También se han descrito dispositivos de electroporación portátiles y de bajo costo, incluyendo un electroporador de mano piezoeléctrico derivado de un encendedor ("ElectroPen") ^{[ 25 ]} y un sistema de electroporación cutánea con matriz de microagujas ("ePatch") diseñado para estudios portátiles de vacunación con ADN. ^{[ 26 ]}

Los primeros estudios sobre campos eléctricos pulsados ​​en biología examinaron el daño a la membrana y la inactivación microbiana. En la década de 1970, se descubrió que al alcanzarse un potencial de membrana crítico, la membrana celular se rompía y posteriormente se recuperaba. ^{[ 27 ]} En la década de 1980, esta ruptura temporal de la membrana se aprovechó para introducir diversas moléculas en las células. ^{[ 28 ]}

Sale y Hamilton (1967–1968) informaron que los pulsos de campo eléctrico de alta intensidad podían matar bacterias y levaduras y propusieron la disrupción de la membrana como un mecanismo clave. ^{[ 29 ] [ 30 ]}

A mediados de la década de 1970, Zimmermann y sus colegas describieron la permeabilización reversible de la membrana inducida por campo eléctrico ("ruptura dieléctrica" ​​/ electropermeabilización) utilizando eritrocitos y bacterias, incluyendo experimentos con un contador Coulter de apertura y mediciones posteriores con electrodos y pulsos de descarga de condensadores. ^{[ 31 ] [ 32 ]}

Los estudios en eritrocitos ayudaron a establecer que los poros podían formarse y sellarse en condiciones controladas. ^{[ 33 ] [ 34 ]} Paralelamente, Auer, Brandner y Bodemer informaron sobre la captación de ADN del SV40 y ARN de mamíferos en glóbulos rojos durante la ruptura dieléctrica. ^{[ 35 ]}

El término electroporación (acuñado por Eberhard Neumann) se popularizó con trabajos que demostraban la transferencia de genes mediada por campos eléctricos en células de mamíferos. ^{[ 36 ]}

La electroporación genética in vivo se describió por primera vez en 1991. ^{[ 37 ]} Este método administra una gran variedad de genes terapéuticos para el posible tratamiento de varias enfermedades, incluyendo trastornos inmunitarios , tumores , trastornos metabólicos , enfermedades monogénicas, enfermedades cardiovasculares y analgesia . ^{[ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]}

En cuanto a la electroporación irreversible, el primer tratamiento exitoso de tumores cutáneos malignos implantados en ratones se logró en 2007 por un grupo de científicos que consiguió la ablación completa del tumor en 12 de 13 ratones. Lo consiguieron enviando 80 pulsos de 100 microsegundos a 0,3 Hz con una magnitud de campo eléctrico de 2500 V/cm para tratar los tumores cutáneos. ^{[ 41 ]}

El primer grupo en aplicar la electroporación utilizó un procedimiento reversible junto con macromoléculas impermeables . La primera investigación sobre cómo se podrían utilizar pulsos de nanosegundos en células humanas se publicó en 2003. ^{[ 42 ]}

La primera aplicación médica de la electroporación se utilizó para introducir fármacos anticancerígenos de baja permeabilidad en nódulos tumorales. ^{[ 43 ]} La electrotransferencia genética pronto despertó interés debido a su bajo costo, facilidad de implementación y supuesta seguridad. Posteriormente, se descubrió que los vectores virales presentan limitaciones en términos de inmunogenicidad y patogenicidad cuando se utilizan para la transferencia de ADN. ^{[ 44 ]}

La electroporación irreversible se utiliza y evalúa como terapia de ablación cardíaca para eliminar áreas específicas del músculo cardíaco. Esto se realiza para tratar irregularidades del ritmo cardíaco . Un catéter cardíaco administra trenes de pulsos eléctricos ultrarrápidos de alto voltaje que forman poros irreversibles en las membranas celulares, lo que provoca la muerte celular. ^{[ 45 ]}

La electroporación permite la introducción celular de moléculas grandes altamente cargadas, como el ADN , que no pueden difundirse pasivamente a través del núcleo hidrofóbico de la bicapa . ^{[ 56 ]} Este fenómeno indica que el mecanismo es la creación de agujeros llenos de agua a escala nanométrica en la membrana. ^{[ 57 ]} Se obtuvieron imágenes ópticas de electroporos en modelos de bicapas lipídicas como bicapas de interfaz de gotas ^{[ 58 ]} y vesículas unilamelares gigantes, ^{[ 59 ]} mientras que la adición de proteínas del citoesqueleto como redes de actina a las vesículas unilamelares gigantes parece prevenir la formación de electroporos visibles. ^{[ 60 ]} También han surgido evidencias experimentales de que las redes de actina regulan la permeabilidad de la membrana celular. ^{[ 61 ]} Aunque tanto la electroporación como la ruptura dieléctrica resultan de la aplicación de un campo eléctrico, los mecanismos involucrados son fundamentalmente diferentes. En la ruptura dieléctrica, el material de la barrera se ioniza, creando una vía conductora. La alteración del material es, por lo tanto, de naturaleza química. En cambio, durante la electroporación las moléculas lipídicas no se alteran químicamente, sino que simplemente cambian de posición, abriendo un poro que actúa como vía conductora a través de la bicapa a medida que se llena de agua.

La electroporación es un fenómeno dinámico que depende del voltaje transmembrana local en cada punto de la membrana celular. Generalmente se acepta que, para una duración y forma de pulso dadas, existe un umbral de voltaje transmembrana específico para la manifestación del fenómeno de electroporación (de 0,5 V a 1 V). Esto lleva a la definición de un umbral de magnitud de campo eléctrico para la electroporación (E _th ). Es decir, solo las células dentro de las áreas donde E≧E _th son electroporadas. Si se alcanza o se supera un segundo umbral (E _ir ), la electroporación comprometerá la viabilidad de las células, es decir , electroporación irreversible (IRE). ^{[ 62 ]}

La electroporación es un proceso con varias fases distintas. ^{[ 63 ] [ 64 ]} Primero, se aplica un pulso eléctrico corto. Los parámetros típicos serían 300–400 mV durante < 1 ms a través de la membrana (nota: los voltajes utilizados en experimentos celulares suelen ser mucho mayores porque se aplican a través de grandes distancias a la solución a granel, por lo que el campo resultante a través de la membrana real es solo una pequeña fracción de la polarización aplicada). La aplicación de este potencial causa la migración de iones de la solución circundante a la membrana que se carga como un capacitor . Se producen rápidos reordenamientos localizados en la morfología lipídica una vez que se alcanza el nivel crítico. Se cree que la estructura resultante es un "preporo" ya que no es eléctricamente conductor pero conduce rápidamente a la creación de un poro conductor. ^{[ 65 ]} La evidencia de la existencia de tales preporos proviene principalmente del "parpadeo" de los poros, lo que sugiere una transición entre estados conductores y aislantes. ^{[ 66 ]} Se ha sugerido que estos preporos son pequeños defectos hidrofóbicos (~3 Å). Si esta teoría es correcta, la transición a un estado conductor podría explicarse por una reorganización en el borde del poro, en la que las cabezas lipídicas se pliegan para crear una interfaz hidrofílica. Finalmente, estos poros conductores pueden repararse, sellando nuevamente la bicapa, o expandirse, llegando a romperla. El resultado depende de si se superó el tamaño crítico del defecto ^{[ 67 ]} , lo cual a su vez depende del campo aplicado, la tensión mecánica local y la energía del borde de la bicapa.

Electrotransferencia genética

La aplicación de pulsos eléctricos de fuerza suficiente a la célula provoca un aumento en la diferencia de potencial transmembrana, lo que provoca la desestabilización de la membrana. La permeabilidad de la membrana celular aumenta y moléculas que de otro modo no serían permeables entran en la célula. ^{[ 68 ] [ 69 ]} Aunque los mecanismos de la electrotransferencia genética aún no se comprenden completamente, se ha demostrado que la introducción de ADN solo ocurre en la parte de la membrana que mira al cátodo y que se necesitan varios pasos para una transfección exitosa: migración electroforética del ADN hacia la célula, inserción del ADN en la membrana, translocación a través de la membrana radial, migración del ADN hacia el núcleo, transferencia del ADN a través de la envoltura nuclear y, finalmente, expresión genética. ^{[ 70 ] Hay una serie de factores que pueden influir en la eficiencia de la electrotransferencia genética, como: temperatura, parámetros de pulsos eléctricos, concentración de ADN, tampón de electroporación utilizado, tamaño celular y capacidad de las células para expresar genes transfectados. [ 71 ]} En ^{la electrotransferencia genética} in vivo , la difusión del ADN a través de la matriz extracelular, las propiedades del tejido y la conductividad general del tejido pueden ser cruciales. ^{[ 72 ]}