Imágenes de calcio

La imagen de calcio es una técnica de microscopía que permite medir ópticamente el estado del calcio (Ca²⁺ ⁾ en una célula , tejido o medio aislado. Esta técnica aprovecha los indicadores de calcio, moléculas fluorescentes que responden a la unión de iones Ca²⁺ ^mediante propiedades de fluorescencia. Existen dos clases principales de indicadores de calcio: indicadores químicos e indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI). ^{[ 1 ]} Esta técnica ha permitido estudiar la señalización del calcio en una amplia variedad de tipos celulares y puede utilizarse para medir la actividad eléctrica en cientos de neuronas en cultivos celulares o en animales vivos durante su comportamiento. ^{[ 2 ]}

Los indicadores químicos son moléculas pequeñas que pueden quelar iones de calcio. Todas estas moléculas se basan en un homólogo del EGTA llamado BAPTA , con alta selectividad para los iones de calcio (Ca ²⁺ ) frente a los iones de magnesio (Mg ²⁺ ).

Este grupo de indicadores incluye fura-2 , indo-1 , fluo-3 , fluo-4 , Calcium Green-1.

Estos colorantes se utilizan a menudo con los grupos carboxilo quelantes enmascarados como ésteres de acetoximetilo , para hacer que la molécula sea lipofílica y permitir una fácil entrada en la célula. Una vez que esta forma del indicador está dentro de la célula, las esterasas celulares liberarán los grupos carboxilo y el indicador podrá unirse al calcio. La forma de ácido libre de los colorantes (es decir, sin la modificación de éster de acetoximetilo) también se puede inyectar directamente en las células mediante un microelectrodo o una micropipeta , lo que elimina las incertidumbres sobre el compartimento celular que contiene el colorante (el éster de acetoximetilo también puede entrar en el retículo endoplasmático y las mitocondrias ). La unión de un ion Ca²⁺ ^a una molécula indicadora fluorescente produce un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia o un desplazamiento de la longitud de onda de emisión/excitación . Los indicadores fluorescentes químicos individuales de Ca²⁺ ^se utilizan para mediciones de calcio citosólico en una amplia variedad de preparaciones celulares. La primera imagen de Ca²⁺ en tiempo real (velocidad de vídeo) ^se realizó en 1986 en células cardíacas utilizando cámaras de vídeo intensificadas. ^{[ 3 ]} El desarrollo posterior de la técnica mediante microscopios confocales de barrido láser reveló señales subcelulares de Ca ²⁺ en forma de chispas de Ca ²⁺ y pulsos de Ca ²⁺ . También se utilizaron respuestas relativas de una combinación de indicadores fluorescentes químicos de Ca ^{2+ para cuantificar transitorios de calcio en} orgánulos intracelulares como las mitocondrias . ^{[ 4 ]}

La obtención de imágenes de calcio, también conocida como mapeo de calcio, se utiliza para realizar investigaciones en tejido miocárdico. ^{[ 5 ]} El mapeo de calcio es una técnica omnipresente que se utiliza en corazones completos y aislados, como los de ratones, ratas y conejos.

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) son herramientas poderosas útiles para la obtención de imágenes in vivo de procesos celulares, de desarrollo y fisiológicos. ^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} Los GECI no necesitan ser cargados agudamente en las células; en cambio, los genes que codifican para estas proteínas pueden introducirse en células individuales o líneas celulares mediante varios métodos de transfección . También es posible crear animales transgénicos que expresen el indicador en todas las células o selectivamente en ciertos subtipos celulares. Los GECI se utilizan para estudiar neuronas, ^{[ 10 ] [ 11 ]} células T , ^{[ 12 ]} cardiomiocitos , ^{[ 13 ]} y otros tipos de células. Algunos GECI informan sobre el calcio mediante la emisión directa de fotones ( luminiscencia ), pero la mayoría se basan en proteínas fluorescentes como reporteros, incluyendo la proteína verde fluorescente GFP y sus variantes (eGFP, YFP, CFP).

De los reporteros fluorescentes, los sistemas indicadores de calcio se pueden clasificar en sistemas de proteína fluorescente (FP) simple y sistemas de proteína fluorescente apareada. Los camgaroos fueron una de las primeras variantes desarrolladas que involucran un sistema de proteína simple. Los camgaroos aprovechan la calmodulina (CaM), una proteína de unión al calcio. En estas estructuras, la CaM se inserta en el medio de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en Y145. Estudios de mutagénesis previos revelaron que las mutaciones en esta posición conferían estabilidad de pH manteniendo las propiedades fluorescentes, lo que convierte a Y145 en un punto de inserción de interés. Además, los extremos N y C de YFP están unidos por un enlace peptídico (GGTGGS). Cuando la CaM se une al Ca2+, el pKa efectivo disminuye, lo que permite la desprotonación del cromóforo . ^{[ 14 ]} Esto resulta en un aumento de la fluorescencia tras la unión del calcio de forma intensiométrica. Esta detección contrasta con los sistemas ratiométricos, en los que hay un cambio en los espectros de absorbancia/emisión como resultado de la unión del Ca2+. ^{[ 15 ]} Un sistema de FP único desarrollado posteriormente, denominado G-CaMP , también utiliza GFP con permutación circular. Uno de los extremos está fusionado con CaM, y el otro con M13 (el dominio de unión a calmodulina de la miosina quinasa ligera) ^{[ 16 ]} La proteína está diseñada de tal manera que los extremos están cerca en el espacio, lo que permite que la unión de Ca2+ cause cambios conformacionales y modulación del cromóforo, permitiendo un aumento de la fluorescencia. G-CaMP y sus variantes refinadas tienen afinidades de unión nanomolares. ^{[ 17 ]} Una variante final de proteína única es CatchER, que generalmente se considera un indicador de menor afinidad. Su bolsillo de unión al calcio es bastante negativo; la unión del catión ayuda a proteger la gran concentración de carga negativa y permite la recuperación de la fluorescencia. ^{[ 18 ]}

En contraste con estos sistemas, existen sistemas de proteínas fluorescentes emparejadas, que incluyen los Cameleones prototípicos . Los Cameleones constan de dos proteínas fluorescentes diferentes, CaM, M13, y un enlazador de glicilglicina. ^{[ 15 ]} En ausencia de Ca2+, solo la proteína fluorescente donante desplazada al azul será fluorescente. Sin embargo, un cambio conformacional causado por la unión del calcio reposiciona la proteína fluorescente desplazada al rojo, lo que permite que tenga lugar la transferencia de energía por resonancia de Förster ( FRET ). Los indicadores Cameleon producen una señal ratiométrica (es decir, la eficiencia FRET medida depende de la concentración de calcio). Las variantes originales de los Cameleones eran originalmente más sensibles al Ca2+ y se apagaban con ácido. ^{[ 19 ]} Estas deficiencias se eliminaron mediante las mutaciones Q69K y V68L. Ambos residuos estaban cerca del cromóforo aniónico enterrado y estas mutaciones probablemente dificultan la protonación, confiriendo una mayor resistencia al pH.

Los GECI de infrarrojo cercano (NIR) son cada vez más importantes en la detección de calcio, ya que pueden abrir nuevas vías para la multiplexación de diferentes sistemas indicadores y permitir una mayor penetración en los tejidos. Los GECI NIR se basan en proteínas fluorescentes que se unen a la biliverdina, derivadas en gran medida de fitocromos bacterianos . Los sistemas NIR son similares a los pericams inversos, ya que ambos experimentan una disminución de la fluorescencia al unirse al Ca2+. Los RCaMP y los RGECO son funcionales a más de 700 nm, pero su fluorescencia es bastante baja. ^{[ 32 ]} También se ha construido con éxito un análogo de Cameleon que utiliza FRET NIR. ^{[ 33 ]}

Una clase especial de GECIs está diseñada para formar una etiqueta fluorescente permanente en neuronas activas. Se basan en la proteína fotosensible Eos , que cambia de verde a rojo mediante la escisión de su cadena principal fotocatalizada (con luz violeta). ^{[ 34 ]} En combinación con la CaM, la luz violeta fotoconvierte solo las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión de CaMPARI2 dirigida a la sinapsis. ^{[ 35 ]}

Aunque los sistemas fluorescentes son ampliamente utilizados, los reporteros bioluminiscentes de Ca2+ también pueden tener potencial debido a su capacidad para anular la autofluorescencia, el fotoblanqueo [no se necesita longitud de onda de excitación], la degradación biológica y la toxicidad, además de mayores relaciones señal-ruido. ^{[ 39 ]} Dichos sistemas pueden basarse en la aequorina y la luciferina coelenterazina. La unión de Ca2+ provoca un cambio conformacional que facilita la oxidación de la coelenterazina. El fotoproducto resultante emite luz azul al regresar al estado fundamental. La colocalización de la aequorina con GFP facilita BRET/CRET (Transferencia de Energía por Resonancia de Bioluminiscencia o Quimioluminiscencia), ^{[ 18 ]} lo que resulta en un aumento de brillo de 19 a 65 veces. ^{[ 39 ]} Dichas estructuras pueden utilizarse para sondear concentraciones de calcio de milimolar a nanomolar. Un sistema similar utiliza obelina y su luciferina coelenteramida, que puede presentar un tiempo de respuesta al calcio más rápido e insensibilidad al Mg2+ que su contraparte aqueorina. ^{[ 40 ]} Estos sistemas también pueden aprovechar el autoensamblaje de los componentes de la luciferasa. En un sistema denominado "nanolinterna", la luciferasa RLuc8 se divide y se coloca en diferentes extremos de CaM. La unión del calcio acerca los componentes de RLuc8, reformando la luciferasa y permitiéndole transferirla a una proteína fluorescente aceptora.

Para minimizar el daño a las células visualizadas, a menudo se recurre a la microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia de los reporteros. ^{[ 41 ]} El uso de longitudes de onda del infrarrojo cercano y la minimización de la dispersión axial de la función puntual ^{[ 42 ]} permite una resolución nanométrica y una penetración profunda en el tejido. El rango dinámico a menudo se determina a partir de tales mediciones. Para indicadores no ratiométricos (típicamente indicadores de proteínas únicas), es la relación de las intensidades de fluorescencia obtenidas en condiciones de saturación y agotamiento de Ca2+, respectivamente. Sin embargo, para indicadores ratiométricos, el rango dinámico es la relación de la relación de eficiencia FRET máxima (saturación de calcio) a la relación de eficiencia FRET mínima (agotamiento de calcio). Otra magnitud común utilizada para medir las señales producidas por los flujos de concentración de calcio es la relación señal-línea base (SBR), que es simplemente la relación del cambio en la fluorescencia (F - F0) sobre la fluorescencia de línea base. Esto se puede relacionar con la SNR (relación señal/ruido) multiplicando la SBR por la raíz cuadrada del número de fotones contados. ^{[ 18 ]}

Independientemente del tipo de indicador utilizado, el procedimiento de obtención de imágenes es generalmente muy similar. Las células cargadas con un indicador, o que lo expresan en el caso de un GECI, ^{[ 43 ]} pueden observarse mediante un microscopio de fluorescencia y capturarse con una cámara CMOS científica (sCMOS) ^{[ 44 ]} o una cámara CCD . Los microscopios confocales y de dos fotones proporcionan capacidad de seccionamiento óptico para que las señales de calcio puedan resolverse en microdominios como espinas dendríticas o botones sinápticos , incluso en muestras gruesas como cerebros de mamíferos. Las imágenes se analizan midiendo los cambios en la intensidad de fluorescencia para una sola longitud de onda o dos longitudes de onda expresadas como una razón (indicadores ratiométricos). Si es necesario, las intensidades de fluorescencia y las razones derivadas pueden representarse gráficamente frente a valores calibrados para niveles conocidos de Ca2 ⁺ para medir concentraciones absolutas de Ca2 ⁺ . Los métodos de microscopía de campo de luz ^{[ 45 ]} amplían las capacidades de lectura funcional de la actividad neuronal en volúmenes 3D.

Métodos como la fotometría de fibra , ^{[ 46 ] [ 47 ]} los miniscopios ^{[ 48 ]} y la microscopía de dos fotones ^{[ 49 ] [ 50 ]} ofrecen imágenes de calcio en modelos animales que se comportan libremente y con la cabeza fija.