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tinción de Gram

Micrografía de un coco grampositivo y un bacilo gramnegativo . Tinción de Gram de una mezcla de Staphylococcus aureus ( S. aureus ATCC 25923, cocos grampositivos , en púrpura) y...

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Micrografía de un coco grampositivo y un bacilo gramnegativo .
Tinción de Gram de una mezcla de Staphylococcus aureus ( S. aureus ATCC 25923, cocos grampositivos , en púrpura) y Escherichia coli ( E. coli ATCC 11775, bacilos gramnegativos , en rojo), las bacterias de referencia más comunes para la tinción de Gram.

La tinción de Gram ( o método de Gram ) es un método de tinción que se utiliza para clasificar las especies bacterianas en dos grandes grupos: bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas . También puede utilizarse para diagnosticar una infección por hongos . [ 1 ] Su nombre proviene del bacteriólogo danés Hans Christian Gram , quien desarrolló la técnica en 1884. [ 2 ]

La tinción de Gram diferencia las bacterias por las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares . Las células Gram positivas tienen una capa gruesa de peptidoglicano en la pared celular que retiene el colorante primario, el cristal violeta . Las células Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano más delgada que permite que el cristal violeta se elimine al añadir etanol . Se tiñen de rosa o rojo con el colorante de contraste , [ 3 ] comúnmente safranina o fucsina . La solución de yodo de Lugol siempre se añade después de la adición del cristal violeta para formar un complejo estable con este último que fortalece la unión del colorante con la pared celular . [ 4 ]

La tinción de Gram es casi siempre el primer paso para la identificación de un grupo bacteriano. Si bien la tinción de Gram es una valiosa herramienta de diagnóstico tanto en entornos clínicos como de investigación, no todas las bacterias pueden clasificarse definitivamente mediante esta técnica. Esto da lugar a los grupos gramvariables y gramindeterminados .

Historia

El método recibe su nombre de su inventor, el científico danés Hans Christian Gram (1853-1938), quien desarrolló la técnica mientras trabajaba con Carl Friedländer en la morgue del hospital municipal de Berlín en 1884. Gram ideó su técnica no para distinguir un tipo de bacteria de otro, sino para hacer que las bacterias fueran más visibles en secciones teñidas de tejido pulmonar. [ 5 ] Gram notó que algunas células bacterianas presentaban una notable resistencia a la decoloración. Basándose en estas observaciones, Gram desarrolló el procedimiento inicial de tinción de Gram, utilizando inicialmente violeta de anilina-genciana de Ehrlich , yodo de Lugol , alcohol absoluto para la decoloración y marrón de Bismarck para la contratinción. [ 6 ] Publicó su método en 1884 e incluyó en su breve informe la observación de que el bacilo del tifus no retenía la tinción. [ 7 ] Inicialmente, Gram no distinguió entre bacterias Gram negativas y Gram positivas utilizando su procedimiento. [ 6 ]

Usos

Tinción de Gram de Candida albicans obtenida de un hisopado vaginal. Las pequeñas clamidosporas ovaladas tienen un diámetro de 2 a 4 μm .

La tinción de Gram es una técnica de laboratorio bacteriológico [ 8 ] que se utiliza para diferenciar las especies bacterianas en dos grandes grupos ( grampositivas y gramnegativas ) según las propiedades físicas de sus paredes celulares . [ 9 ] La tinción de Gram también se puede utilizar para diagnosticar una infección fúngica . [ 1 ] La tinción de Gram no se utiliza para clasificar las arqueas , ya que estos microorganismos producen respuestas muy variables que no se ajustan a sus grupos filogenéticos . [ 10 ]

Las tinciones de Gram se realizan en fluidos corporales o biopsias cuando se sospecha una infección . Las tinciones de Gram proporcionan resultados mucho más rápidamente que los cultivos y son especialmente importantes cuando la infección podría tener un impacto significativo en el tratamiento y el pronóstico del paciente; por ejemplo, el líquido cefalorraquídeo para la meningitis y el líquido sinovial para la artritis séptica . [ 11 ] [ 12 ]

Mecanismo de tinción

Bacterias grampositivas teñidas de púrpura (izquierda) y bacterias gramnegativas teñidas de rosa (derecha).

Las bacterias grampositivas tienen una pared celular gruesa en forma de malla compuesta de peptidoglicano (50-90% de la envoltura celular) y, como resultado, se tiñen de púrpura con cristal violeta, mientras que las bacterias gramnegativas tienen una capa más delgada (10% de la envoltura celular), por lo que no retienen la tinción púrpura y se contratiñen de rosa con safranina. La tinción de Gram consta de cuatro pasos básicos:

  1. Aplicación de una tinción primaria ( cristal violeta ) a una muestra de cultivo bacteriano fijada por calor. La fijación por calor elimina algunas bacterias, pero se utiliza principalmente para fijarlas al portaobjetos y evitar que se desprendan durante el proceso de tinción.
  2. La adición de yodo , que se une al cristal violeta y lo atrapa en la célula.
  3. Decoloración rápida con etanol o acetona.
  4. Contratinción con safranina . [ 13 ] A veces se sustituye la safranina por fucsina carbol, ya que tiñe más intensamente las bacterias anaerobias, pero se usa con menos frecuencia como contratinción. [ 14 ]

El violeta cristal (CV) se disocia en soluciones acuosas en CV +y cloruro ( Cl −) iones. Estos iones penetran la pared celular tanto de las células grampositivas como de las gramnegativas. El CV +El ion interactúa con los componentes cargados negativamente de las células bacterianas y tiñe las células de púrpura. [ 15 ]

Yoduro ( I −o I − 3 ) interactúa con CV +y forma grandes complejos de cristal violeta y yodo (CV–I) dentro de las capas internas y externas de la célula. El yodo suele denominarse mordiente , pero es un agente de atrapamiento que impide la eliminación del complejo CV–I y, por lo tanto, colorea la célula. [ 16 ]

Cuando se añade un decolorante como alcohol o acetona, este interactúa con los lípidos de la membrana celular. [ 17 ] Una célula gramnegativa pierde su membrana externa de lipopolisacáridos, y la capa interna de peptidoglicano queda expuesta. Los complejos CV-I se eliminan de la célula gramnegativa junto con la membrana externa. [ 18 ] Por el contrario, una célula grampositiva se deshidrata con un tratamiento con etanol. Los grandes complejos CV-I quedan atrapados dentro de la célula grampositiva debido a la naturaleza multicapa de su peptidoglicano. [ 18 ] El paso de decoloración es crítico y debe realizarse en el momento preciso; la tinción de cristal violeta se elimina tanto de las células grampositivas como de las gramnegativas si el agente decolorante se deja actuar demasiado tiempo (unos segundos). [ 19 ]

Tras la decoloración, la célula grampositiva permanece púrpura y la célula gramnegativa pierde su color púrpura. [ 19 ] El colorante de contraste, que suele ser safranina o fucsina básica con carga positiva, se aplica al final para dar a las bacterias gramnegativas decoloradas un color rosa o rojo. [ 3 ] [ 20 ] Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas captan el colorante de contraste. Sin embargo, este colorante no se observa en las bacterias grampositivas debido a la tinción más oscura del cristal violeta.

Ejemplos

bacterias Gram positivas

Tinción de Gram de estreptococos grampositivos rodeados de células de pus.

Las bacterias Gram positivas generalmente tienen una sola membrana ( monodermo ) rodeada por un peptidoglicano grueso. Esta regla la siguen dos filos: Bacillota (excepto las clases Mollicutes y Negativicutes ) y Actinomycetota . [ 9 ] [ 21 ] En contraste, los miembros de Chloroflexota (bacterias verdes no sulfurosas) son monodermos pero poseen un peptidoglicano delgado o ausente (clase Dehalococcoidetes ) y pueden teñirse de forma negativa, positiva o indeterminada; los miembros de Deinococcota se tiñen de forma positiva pero son didermos con un peptidoglicano grueso. [ 9 ] [ 21 ]

La resistencia de la pared celular se ve reforzada por los ácidos teicoicos, sustancias glicopoliméricas incrustadas en el peptidoglicano. Los ácidos teicoicos desempeñan múltiples funciones, como generar la carga negativa neta de la célula, contribuir a la rigidez de la pared celular y al mantenimiento de su forma, y ​​ayudar en la división celular y la resistencia a diversos factores de estrés, como el calor y la sal. A pesar de la densidad de la capa de peptidoglicano, esta permanece relativamente porosa, lo que permite el paso de la mayoría de las sustancias. Para nutrientes de mayor tamaño, las bacterias Gram positivas utilizan exoenzimas, secretadas extracelularmente, para descomponer macromoléculas fuera de la célula. [ 22 ]

Históricamente , las formas grampositivas conformaban el filo Firmicutes , nombre que ahora se utiliza para el grupo más grande. Incluye muchos géneros conocidos como Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus y Clostridium . [ 23 ] También se ha ampliado para incluir los Mollicutes, bacterias como Mycoplasma y Thermoplasma que carecen de pared celular y, por lo tanto, no se pueden teñir con la tinción de Gram, pero que derivan de dichas formas. [ 24 ]

Algunas bacterias poseen paredes celulares particularmente retentivas de tinciones. Estas darán positivo en la tinción de Gram, aunque no estén estrechamente relacionadas con otras bacterias grampositivas. Se denominan bacterias ácido-resistentes y solo pueden diferenciarse de otras bacterias grampositivas mediante procedimientos de tinción especiales . [ 25 ]

bacterias Gram negativas

Neisseria gonorrhoeae gramnegativa y células de pus

Las bacterias gramnegativas generalmente poseen una fina capa de peptidoglicano entre dos membranas ( didermo ). [ 26 ] El lipopolisacárido (LPS) es el antígeno más abundante en la superficie celular de la mayoría de las bacterias gramnegativas, contribuyendo hasta al 80% de la membrana externa de E. coli y Salmonella . [ 27 ] Estas moléculas de LPS, que consisten en el antígeno O o polisacárido O, el polisacárido central y el lípido A, cumplen múltiples funciones, incluyendo contribuir a la carga negativa de la célula y protegerla contra ciertas sustancias químicas. El papel del LPS es crítico en las interacciones huésped-patógeno, donde el antígeno O desencadena una respuesta inmune y el lípido A actúa como una endotoxina. [ 22 ]

Además, la membrana externa actúa como una barrera selectiva, regulada por porinas, proteínas transmembrana que forman poros que permiten el paso de moléculas específicas. El espacio entre la membrana celular y la membrana externa, conocido como periplasma, contiene enzimas periplásmicas para el procesamiento de nutrientes. Un componente estructural importante que une la capa de peptidoglicano y la membrana externa es la lipoproteína de Braun, que proporciona estabilidad y resistencia adicionales a la pared celular bacteriana. [ 22 ]

La mayoría de los filos bacterianos son gramnegativos, incluyendo las cianobacterias , las bacterias verdes del azufre y la mayoría de los Pseudomonadota (con la excepción de algunos miembros de los Rickettsiales y los endosimbiontes de insectos de los Enterobacteriales ). [ 9 ] [ 21 ]

Bacterias gramvariables y gramindeterminadas

Algunas bacterias, tras la tinción de Gram, presentan un patrón gramvariable: se observa una mezcla de células rosadas y púrpuras. [ 18 ] [ 28 ] En cultivos de Bacillus, Butyrivibrio y Clostridium , una disminución del grosor del peptidoglicano durante el crecimiento coincide con un aumento del número de células que se tiñen de gramnegativas. [ 28 ] Además, en todas las bacterias teñidas con la tinción de Gram, la edad del cultivo puede influir en los resultados de la tinción. [ 28 ]

Las bacterias Gram indeterminadas no responden de forma predecible a la tinción de Gram y, por lo tanto, no se pueden determinar como Gram positivas o Gram negativas. Ejemplos de ello son muchas especies de Mycobacterium , como Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis , siendo estas dos últimas los agentes causantes de la lepra y la tuberculosis, respectivamente. [ 29 ] [ 30 ] Las bacterias del género Mycoplasma carecen de pared celular alrededor de sus membranas celulares , [ 11 ] lo que significa que no se tiñen con el método de Gram y son resistentes a los antibióticos que actúan sobre la síntesis de la pared celular. [ 31 ] [ 32 ]

Nota ortográfica

El término tinción de Gram deriva del apellido de Hans Christian Gram ; por lo tanto, el epónimo (Gram) se escribe con mayúscula, pero no el sustantivo común (tinción), como es habitual en los términos científicos. [ 33 ] Las letras iniciales de grampositivo y gramnegativo , que son adjetivos epónimos , pueden ser mayúscula G o minúscula g , según la guía de estilo (si la hay) que rija el documento que se esté escribiendo. El estilo en minúsculas es utilizado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU . y otros regímenes de estilo como el estilo AMA . [ 34 ] Los diccionarios pueden usar minúsculas, [ 35 ] [ 36 ] mayúsculas, [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] o ambas. [ 41 ] [ 42 ] El uso de mayúsculas para Grampositivo o Gramnegativo también es común en muchos artículos y publicaciones de revistas científicas . [ 42 ] [ 43 ] [ 44 ] Cuando se envían artículos a revistas, cada revista puede o no aplicar el estilo propio a la versión postprint . Las versiones preprint contienen el estilo que el autor haya utilizado. Incluso los regímenes de estilo que utilizan minúsculas para los adjetivos grampositivo y gramnegativo suelen seguir utilizando mayúsculas para la tinción de Gram .

Véase también

Referencias

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  • Vídeo sobre la técnica de tinción de Gram
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