Granada mediano

El medio Granada es un medio de cultivo selectivo y diferencial diseñado para aislar selectivamente Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B, EGB) y diferenciarlo de otros microorganismos. El medio Granada fue desarrollado por Manuel Rosa-Fraile et al. en el Servicio de Microbiología del Hospital Virgen de las Nieves de Granada (España). ^{[ 1 ]}

La identificación de GBS en medio granada es sencilla y se basa en la detección de granadaeno , un pigmento poliénico rojo específico de GBS. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}

El medio Granada es comercializado en los EE. UU. por Hardy Diagnostics ^{[ 5 ]} y en la Unión Europea y el Reino Unido como marca comercial (®) por Biomerieux ^{[ 6 ]} y Becton Dickinson . ^{[ 7 ]}

pH 7,45±0,1

El medio Granada se desarrolló para el aislamiento selectivo y la identificación de GBS a partir de muestras clínicas. ^{[ 1 ]} La producción de un pigmento rojo ( granadaeno ) en el medio Granada es exclusiva de los estreptococos del grupo B β- hemolíticos aislados de humanos. ^{[ 8 ]}

El granadeneno es un pigmento poliénico no isoprenoide (ornitinoramnododecaeno) con un sistema conjugado de 12 enlaces dobles. ^{[ 3 ] [ 9 ] [ 10 ]}

La β-hemólisis y la producción de pigmento están codificadas en GBS por un grupo de 12 genes, el grupo cyl . ^{[ 11 ] [ 12 ]} Además, se ha sugerido que el pigmento y la hemolisina de GBS son moléculas idénticas o estrechamente relacionadas. También se ha informado que son factores importantes que contribuyen a la virulencia de GBS. ^{[ 8 ] [ 13 ] [ 14 ]}

Componentes

El agar Granada consiste principalmente en un agar de almidón , peptona y proteosa tamponado con MOPS (un tampón de Good ) y fosfato, y suplementado con metotrexato y antibióticos. ^{[ 1 ]} La peptona y proteosa, el suero de caballo, la glucosa y el piruvato de sodio proporcionan nutrientes para el crecimiento de Streptococcus agalactiae ; el piruvato de sodio también proporciona un efecto protector contra las especies reactivas de oxígeno (ROS). El MOPS y el fosfato tamponan el medio. El metotrexato desencadena la producción de pigmento ^{[ 8 ]} y el almidón estabiliza el pigmento. ^{[ 8 ]} El suplemento selectivo contiene los antibióticos colistina (inhibidor para bacterias gramnegativas) y metronidazol (inhibidor para bacterias anaerobias), y cristal violeta para suprimir las bacterias grampositivas acompañantes .

Un componente clave del medio granada es la peptona de proteosa N3 (Difco & BD). Esta peptona péptica fue desarrollada por DIFCO (Digestive Ferments Company) durante la Primera Guerra Mundial para la producción de toxinas bacterianas destinadas a la fabricación de vacunas. ^{[ 15 ]} Para el desarrollo de colonias de GBS de color rojo ladrillo en el medio granada, es necesaria la presencia del péptido Ile-Ala-Arg-Arg-His-Pro-Tyr-Phe en el medio de cultivo. Este péptido se produce únicamente durante la hidrólisis de la albúmina de mamíferos por la pepsina. ^{[ 16 ]}

Para una producción óptima de pigmentos, también es necesario que la peptona contenga otras sustancias (actualmente no caracterizadas) de los tejidos de la pared gastrointestinal de mamíferos utilizados para preparar algunas peptonas. ^{[ 17 ]}

La presencia de almidón es un requisito básico para estabilizar el pigmento, permitiendo el desarrollo de colonias rojas de GBS. ^{[ 8 ]} Sin embargo, si se utiliza almidón soluble, se obtiene un medio de cultivo que se deteriora rápidamente a temperatura ambiente debido a que el almidón soluble es hidrolizado por la amilasa del suero (añadido como suplemento). Este inconveniente puede solucionarse prescindiendo del suero o utilizando almidones no modificados para preparar el medio de cultivo, ya que estos últimos son más resistentes a la acción hidrolítica de la amilasa. ^{[ 18 ]}

GBS crece en agar granada como colonias rosa-rojizas después de 18–48 horas de incubación (35–37  °C), se obtienen mejores resultados en anaerobiosis (cultivo en un ambiente anaeróbico). ^{[ 1 ]} El agar granada se utiliza para el aislamiento primario, la identificación y el cribado de GBS β-hemolítico a partir de muestras clínicas. ^{[ 2 ] [ 4 ]} Este medio de cultivo es selectivo para GBS, otros microorganismos (como enterococos y levaduras ), resistentes a los agentes selectivos utilizados, pueden desarrollarse como colonias incoloras o blancas. ^{[ 2 ]}

El agar Granada es útil para el cribado de mujeres embarazadas para la detección de la colonización vaginal y rectal por GBS para usar profilaxis antibiótica intraparto para evitar la infección temprana por GBS en el recién nacido. ^{[ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]}

También se ha sugerido que la pigmentación de GBS en agar Granada puede ayudar a identificar a mujeres embarazadas y recién nacidos con mayor riesgo de desarrollar enfermedad invasiva por GBS. ^{[ 23 ]}

Las muestras se pueden sembrar directamente en una placa de agar granada o después de un paso de enriquecimiento para obtener el máximo aislamiento. ^{[ 20 ]} Las muestras deben sembrarse lo antes posible después de recibirlas en el laboratorio. Si el material se cultiva a partir de un hisopo (por ejemplo, de un hisopo vaginal o vaginorrectal), extienda el hisopo directamente sobre la placa de agar para asegurar una exposición adecuada del hisopo al medio y lograr la máxima transferencia de microorganismos. Coloque el cultivo en un ambiente anaeróbico, incúbelo a 35-37  °C y examínelo después de la incubación nocturna y nuevamente después de aproximadamente 48 horas. ^{[ 1 ]}

Para aumentar la recuperación de GBS, los hisopos también pueden inocularse previamente en un medio de cultivo de enriquecimiento selectivo, como el caldo Todd-Hewitt suplementado con gentamicina o colistina y ácido nalidíxico , e incubarse durante 18-24 horas a 35-37  °C. ^{[ 20 ] [ 24 ]}

Las colonias de GBS β-hemolítico aparecen en el medio granada como colonias rosadas o rojas, y se distinguen fácilmente de otros microorganismos que también puedan haber crecido en la placa. Cualquier grado de desarrollo naranja debe considerarse indicativo de una colonia de GBS, y no son necesarias pruebas de identificación adicionales. ^{[ 2 ]} El GBS no β-hemolítico se desarrolla en agar granada como colonias blancas que, si es necesario, pueden analizarse mediante aglutinación de látex o la prueba CAMP . ^{[ 4 ] [ 20 ]}

Las placas de agar Granada también se pueden incubar aeróbicamente, siempre que se coloque un cubreobjetos sobre el inóculo en la placa. ^{[ 2 ]}

El medio Granada también puede usarse como medio líquido (caldos Granada) ^{[ 25 ]} como el caldo de zanahoria Strep B ^{[ 26 ]} Cuando se utilizan medios Granada líquidos, no es necesaria la incubación anaeróbica. ^{[ 2 ]}

La β-hemólisis y la producción de pigmento (granadaeno) están codificadas en GBS por un grupo de genes de 12 genes, el grupo cyl . ^{[ 11 ] [ 12 ]}

Además, se ha sugerido que el pigmento y la hemolisina de GBS son moléculas idénticas o estrechamente relacionadas, y también se ha informado que son factores importantes que contribuyen a la virulencia de GBS. ^{[ 8 ] [ 13 ] [ 14 ]}

Sin embargo, entre el 1 y el 5 % de las cepas de GBS no son hemolíticas y no producen pigmento. ^{[ 8 ]} No obstante, estas cepas de GBS no hemolíticas y no pigmentadas (que carecen de pigmento y hemolisina) se consideran menos virulentas. ^{[ 13 ] [ 14 ] [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]}