Su etiqueta

Las etiquetas de polihistidina suelen constar de seis residuos de histidina. Sin embargo, no son infrecuentes las etiquetas con hasta doce residuos de histidina o las etiquetas duales unidas mediante un enlace corto, que pueden mejorar los resultados de purificación al potenciar la unión a la resina de afinidad, permitiendo una mayor rigurosidad en el lavado y la separación de las proteínas endógenas. ^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]} La etiqueta se puede añadir a un gen de interés utilizando métodos comunes a la mayoría de las etiquetas de purificación . El método más básico consiste en subclonar el gen de interés en un vector que contenga una secuencia de etiqueta de polihistidina. Existen muchos vectores disponibles para su uso con diversos sistemas de expresión, con etiquetas de polihistidina en diversas posiciones y con diferentes sitios de escisión por proteasa, otras etiquetas, etc. [ ^{9 ] No} obstante, si no se dispone de un vector adecuado o si la etiqueta debe insertarse en una ubicación distinta del extremo N o C de las proteínas, el gen de interés puede sintetizarse directamente conteniendo una secuencia de etiqueta de polihistidina o bien se pueden utilizar diversos métodos basados ​​en PCR para añadir la etiqueta a un gen. Un enfoque común es agregar la secuencia codificante para la etiqueta de polihistidina a los cebadores de PCR como un extremo saliente. ^{[ 10 ] [ 11 ]}

Lo más común es que una etiqueta de polihistidina se fusione al extremo N o C de una proteína y se una mediante un enlace corto y flexible, que puede contener un sitio de escisión por proteasa. ^{[ 10 ] [ 9 ]} Con menos frecuencia, las etiquetas pueden agregarse tanto al extremo N como al extremo C o insertarse en una parte intermedia de una proteína, como dentro de un bucle expuesto. ^{[ 12 ] [ 8 ]} La elección de la posición de la etiqueta depende de las propiedades de cada proteína y de la estrategia de purificación elegida; puede ser necesario probar múltiples construcciones con la etiqueta en diferentes posiciones. ^{[ 6 ] [ 10 ]} Aunque se considera que las etiquetas de polihistidina generalmente no alteran las propiedades de una proteína, se ha demostrado que la adición de la etiqueta puede causar efectos no deseados, como influir en el estado oligomérico de la proteína. ^{[ 13 ]}

En el mercado existen diversas matrices portadoras unidas a un soporte de resina sólida, las cuales pueden cargarse posteriormente con un catión metálico. Los derivados del ácido iminodiacético (IDA) y del ácido nitrilotriacético (NTA) son los más utilizados para este fin, y las diferentes matrices presentan ciertas ventajas y desventajas para diversas aplicaciones. ^{[ 14 ]}

Varios cationes metálicos presentan alta afinidad por el imidazol, el grupo funcional de la etiqueta His. Los complejos de imidazol con cationes divalentes M²⁺ ⁽ M = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, etc. ) y metales de transición son los más utilizados para este fin. La elección del catión suele ser un compromiso entre la capacidad de unión y la pureza. El níquel se utiliza a menudo, ya que ofrece un buen equilibrio entre estos factores, mientras que el cobalto puede utilizarse cuando se desea aumentar la pureza de la purificación, dado que tiene menor afinidad por las proteínas endógenas; sin embargo, su capacidad de unión es menor en comparación con el níquel. ^{[ 14 ] [ 10 ]}

Para eluir la proteína con etiqueta His del soporte, existen varios métodos potenciales que pueden combinarse si es necesario. Para evitar la desnaturalización de las proteínas, generalmente se recomienda utilizar un método lo más suave posible.

• Competencia con productos análogos

Para liberar la proteína con etiqueta His del soporte, se utiliza un compuesto con una estructura similar a la etiqueta His que, además, forma un complejo de coordinación con los iones metálicos inmovilizados. Este compuesto, añadido a la proteína con etiqueta His en el soporte, compite con la proteína por los iones metálicos inmovilizados. El compuesto, añadido a alta concentración, reemplaza prácticamente toda la proteína unida al soporte, la cual se eluye del mismo. El imidazol es la cadena lateral de la histidina y se suele utilizar a una concentración de 100 a 500 mM para la elución. También se puede utilizar histidina.

• Disminución del pH

Cuando el pH disminuye, el residuo de histidina se protona y ya no puede coordinarse con la etiqueta metálica, lo que permite la elución de la proteína. Cuando se utiliza níquel como ion metálico, la elución se produce alrededor de un pH de 4, y la del cobalto, alrededor de un pH de 6.

• Eliminación de iones metálicos

Cuando se añade un agente quelante fuerte como el EDTA , la proteína se desprende del soporte porque se pierde el ion metálico inmovilizado en este.