electroforesis en gel de poliacrilamida

Las muestras pueden ser cualquier material que contenga proteínas o ácidos nucleicos. Estos pueden ser de origen biológico, por ejemplo, de células procariotas o eucariotas, tejidos, virus, muestras ambientales o proteínas purificadas. En el caso de tejidos o células sólidas, a menudo se desintegran mecánicamente mediante una licuadora (para volúmenes de muestra mayores), un homogeneizador (para volúmenes menores), un sonicador o mediante ciclos de alta presión. Posteriormente, se puede utilizar una combinación de técnicas bioquímicas y mecánicas —incluidos diversos tipos de filtración y centrifugación— para separar los diferentes compartimentos celulares y orgánulos antes de la electroforesis. También se pueden utilizar biomoléculas sintéticas, como oligonucleótidos, como analitos.

La muestra a analizar se mezcla opcionalmente con un desnaturalizante químico si se desea, generalmente SDS para proteínas o urea para ácidos nucleicos. El SDS es un detergente aniónico que desnaturaliza las estructuras secundarias y terciarias no unidas por enlaces disulfuro, y además aplica una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa. La urea rompe los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases del ácido nucleico, lo que provoca la separación de las cadenas constituyentes. Calentar las muestras a al menos 60  °C promueve aún más la desnaturalización. ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]}

Además del SDS, las proteínas pueden calentarse brevemente hasta casi el punto de ebullición en presencia de un agente reductor, como el ditiotreitol (DTT) o el 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol/BME) . Esto desnaturaliza aún más las proteínas al reducir los enlaces disulfuro, superando así algunos tipos de plegamiento terciario y desintegrando la estructura cuaternaria (subunidades oligoméricas). Este proceso se conoce como electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS reductora (SDS-PAGE reductora).

Se puede añadir un colorante de seguimiento a la solución. Este colorante suele tener una movilidad electroforética mayor que la de los analitos, lo que permite al experimentador seguir el recorrido de la solución a través del gel durante la electroforesis.

Los geles suelen consistir en acrilamida, bisacrilamida , el desnaturalizante opcional (SDS o urea) y un tampón con pH ajustado. La solución puede desgasificarse al vacío para evitar la formación de burbujas de aire durante la polimerización. Alternativamente, se puede añadir butanol al gel de resolución (para proteínas) después de verterlo, ya que el butanol elimina las burbujas y alisa la superficie. ^{[ 12 ]} Se añade una fuente de radicales libres y un estabilizador, como persulfato de amonio y TEMED, para iniciar la polimerización. ^{[ 13 ]} La reacción de polimerización crea un gel debido a la bisacrilamida añadida, que puede formar enlaces cruzados entre dos moléculas de acrilamida. La proporción de bisacrilamida a acrilamida puede variar para fines específicos, pero generalmente es de aproximadamente 1 parte en 35. La concentración de acrilamida del gel también puede variar, generalmente en el rango del 5 % al 25 %. Los geles con menor porcentaje son mejores para resolver moléculas de muy alto peso molecular, mientras que se necesitan porcentajes mucho mayores de acrilamida para resolver proteínas más pequeñas. El diámetro promedio de los poros de los geles de poliacrilamida está determinado por la concentración total de acrilamidas (% T, donde T = concentración total de acrilamida y bisacrilamida) y la concentración del agente reticulante bisacrilamida (% C, donde C = concentración de bisacrilamida). ^{[ 14 ]} El tamaño de los poros se reduce recíprocamente al %T. En cuanto al %C, una concentración del 5% produce los poros más pequeños, ya que la influencia de la bisacrilamida en el tamaño de los poros tiene forma de parábola con un vértice en el 5%.

Los geles se polimerizan habitualmente entre dos placas de vidrio en una máquina de electroforesis, a la que se le inserta un peine en la parte superior para crear los pocillos de muestra. Una vez polimerizado el gel, se puede retirar el peine y el gel queda listo para la electroforesis.

En la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se utilizan diversos sistemas de tampón según la naturaleza de la muestra y el objetivo experimental. Los tampones utilizados en el ánodo y el cátodo pueden ser iguales o diferentes. ^{[ 10 ] [ 15 ] [ 16 ]}

Se aplica un campo eléctrico a través del gel, lo que provoca que las proteínas o ácidos nucleicos con carga negativa migren a través del gel, alejándose del electrodo negativo (que es el cátodo, ya que se trata de una celda electrolítica y no galvánica) y dirigiéndose hacia el electrodo positivo (el ánodo). Dependiendo de su tamaño, cada biomolécula se mueve de manera diferente a través de la matriz del gel: las moléculas pequeñas se deslizan con mayor facilidad por los poros del gel, mientras que las más grandes tienen mayor dificultad. El gel se mantiene en funcionamiento durante varias horas, aunque esto depende del voltaje aplicado; la migración se produce más rápidamente a voltajes más altos, pero estos resultados suelen ser menos precisos que los obtenidos a voltajes más bajos. Transcurrido el tiempo establecido, las biomoléculas han migrado distancias diferentes según su tamaño. Las biomoléculas más pequeñas se desplazan más lejos a lo largo del gel, mientras que las más grandes permanecen más cerca del punto de origen. Por lo tanto, las biomoléculas pueden separarse aproximadamente según su tamaño, que depende principalmente del peso molecular en condiciones desnaturalizantes, pero también de la conformación de orden superior en condiciones nativas. La movilidad del gel se define como la velocidad de migración recorrida con un gradiente de voltaje de 1 V/cm y tiene unidades de cm² ^/ s/V. ^{[ 4 ] : ​​161–3} Para fines analíticos, la movilidad relativa de las biomoléculas, R _{_f} , la relación entre la distancia que la molécula recorrió en el gel y la distancia total recorrida por un colorante de seguimiento, se representa gráficamente frente al peso molecular de la molécula (o a veces el logaritmo del peso molecular, o más bien el radio molecular Mr ₎ . Estas gráficas, típicamente lineales, representan los marcadores estándar o curvas de calibración que se utilizan ampliamente para la estimación cuantitativa de diversos tamaños de biomoléculas. ^{[ 4 ] : ​​161–3}

Sin embargo, ciertas glicoproteínas se comportan de manera anómala en geles SDS. Además, se ha informado que el análisis de proteínas más grandes, que oscilan entre 250 000 y 600 000 Da, también resulta problemático debido a que dichos polipéptidos se mueven de forma inadecuada en los sistemas de gel que se utilizan habitualmente. ^{[ 17 ]}

Tras la electroforesis, el gel puede teñirse (para proteínas, generalmente con azul brillante de Coomassie R-250 o autorradiografía; para ácidos nucleicos, con bromuro de etidio ; o, en ambos casos, con tinción de plata ), lo que permite visualizar las proteínas separadas, o bien procesarse posteriormente (por ejemplo, mediante Western blot ). Tras la tinción, las biomoléculas de diferentes especies aparecen como bandas distintas dentro del gel. Es habitual utilizar marcadores de peso molecular conocido en una calle aparte del gel para calibrarlo y determinar la masa molecular aproximada de las biomoléculas desconocidas comparando la distancia recorrida con respecto al marcador.

Para las proteínas, la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) suele ser la primera opción para determinar su pureza debido a su fiabilidad y facilidad de uso. La presencia de SDS y la desnaturalización provocan la separación de las proteínas, aproximadamente en función de su tamaño, aunque puede producirse una migración anómala de algunas. Además, las distintas proteínas pueden teñirse de forma diferente, lo que dificulta la cuantificación mediante tinción. La PAGE también puede utilizarse como técnica preparativa para la purificación de proteínas. Por ejemplo, la PAGE nativa preparativa es un método para separar metaloproteínas nativas en matrices biológicas complejas. ^{[ 18 ]}

Los geles de poliacrilamida se componen de un gel de apilamiento y un gel de separación. Los geles de apilamiento tienen una mayor porosidad que el gel de separación y permiten que las proteínas migren en un área concentrada. Además, los geles de apilamiento suelen tener un pH de 6,8, ya que las moléculas neutras de glicina permiten una mayor movilidad de las proteínas. Los geles de separación tienen un pH de 8,8, donde la glicina aniónica ralentiza la movilidad de las proteínas. Los geles de separación permiten la separación de proteínas y tienen una porosidad relativamente menor. En este caso, las proteínas se separan según su tamaño (en SDS-PAGE) y su relación tamaño/carga (PAGE nativa). ^{[ 22 ]}

El tampón químico estabiliza el pH al valor deseado tanto dentro del gel como en el tampón de electroforesis. La elección del tampón también afecta la movilidad electroforética de los contraiones del tampón y, por lo tanto, la resolución del gel. El tampón debe ser inerte y no modificar ni reaccionar con la mayoría de las proteínas. Se pueden usar diferentes tampones como tampón de cátodo y ánodo, respectivamente, según la aplicación. Se pueden usar varios valores de pH dentro de un mismo gel, por ejemplo, en la electroforesis DISC. Los tampones comunes en PAGE incluyen Tris , Bis-Tris o imidazol .

Los contraiones equilibran la carga intrínseca del ion tampón y también afectan la fuerza del campo eléctrico durante la electroforesis. Los iones altamente cargados y móviles suelen evitarse en los tampones del cátodo de SDS-PAGE, pero pueden incluirse en el propio gel, donde migran por delante de la proteína. En aplicaciones como DISC SDS-PAGE, los valores de pH dentro del gel pueden variar para cambiar la carga promedio de los contraiones durante la corrida y mejorar la resolución. Los contraiones más comunes son la glicina y la tricina . La glicina se ha utilizado como fuente de ion de arrastre o ion lento porque su pKa es 9,69 y la movilidad del glicinato es tal que la movilidad efectiva puede establecerse en un valor inferior al de las proteínas más lentas conocidas con carga neta negativa en el rango de pH. El pH mínimo de este rango es aproximadamente 8,0.

Cuando la acrilamida ( C₃H₅NO₃ ; mW: 71,08 ) se disuelve en agua, se produce una autopolimerización lenta y espontánea, en _{la que las moléculas se unen cabeza con cola para formar largos polímeros de} cadena simple. La presencia de un sistema generador de radicales libres acelera considerablemente la polimerización. Este tipo de reacción se conoce como polimerización por adición vinílica . Una solución de estas cadenas poliméricas se vuelve viscosa, pero no forma un gel, ya que las cadenas simplemente se deslizan unas sobre otras. La formación de gel requiere la unión de varias cadenas. La acrilamida es carcinogénica , ^{[ 23 ]} una neurotoxina y una toxina reproductiva. ^{[ 24 ]} También es esencial almacenar la acrilamida en un lugar fresco, oscuro y seco para reducir la autopolimerización y la hidrólisis .

_La bisacrilamida ( N , N′ -metilenbisacrilamida ) ( C7H10N2O2 ; _peso molecular : _154,17 ) es el agente reticulante más utilizado en geles de poliacrilamida. Químicamente _, se puede considerar como dos moléculas de acrilamida unidas cabeza con cabeza por sus extremos no reactivos. La bisacrilamida puede reticular dos cadenas de poliacrilamida entre sí, dando como resultado un gel.

El dodecilsulfato de sodio (SDS) ( C ₁₂ H ₂₅ NaO ₄ S ; mW: 288,38) (utilizado únicamente en geles de proteínas desnaturalizantes) es un detergente fuerte que se utiliza para desnaturalizar proteínas nativas en polipéptidos individuales . Esta desnaturalización, denominada desnaturalización reconstructiva, no se logra mediante la linealización total de la proteína, sino a través de un cambio conformacional a una combinación de estructuras secundarias de ovillo aleatorio y hélice α. ^{[ 7 ]} Cuando una mezcla de proteínas se calienta a 100 °C en presencia de SDS, el detergente se enrolla alrededor del esqueleto polipeptídico. Se une a los polipéptidos en una proporción de peso constante de 1,4 g de SDS/g de polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven insignificantes en comparación con las cargas negativas aportadas por el SDS. Así, tras el tratamiento, los polipéptidos se convierten en estructuras alargadas con una densidad de carga uniforme, es decir, la misma carga negativa neta por unidad de peso. La movilidad electroforética de estas proteínas es una función lineal de los logaritmos de sus pesos moleculares. Sin SDS, diferentes proteínas con pesos moleculares similares migrarían de forma distinta debido a las diferencias en la relación masa-carga, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico y un peso molecular específicos de su estructura primaria . Esto se conoce como PAGE nativa . La adición de SDS resuelve este problema, ya que se une a la proteína y la despliega, generando una carga negativa casi uniforme a lo largo del polipéptido. 

La urea ( CO(NH ₂ ) ₂ ; mW: 60,06) es un agente caotrópico que aumenta la entropía del sistema al interferir con las interacciones intramoleculares mediadas por fuerzas no covalentes como los enlaces de hidrógeno y las fuerzas de van der Waals . La estructura macromolecular depende del efecto neto de estas fuerzas, por lo tanto, se deduce que un aumento de solutos caotrópicos desnaturaliza las macromoléculas.

El persulfato de amonio ₍ APS) ( N₂H₈S₂O₈ ; _{peso molecular} : 228,2 ) es una fuente de radicales libres y se utiliza frecuentemente como iniciador para la formación de geles. Una fuente alternativa de radicales libres es _la riboflavina , que los genera en una reacción fotoquímica .

La N , N , N ′, N′ _- tetrametiletilendiamina (TEMED) ( C₆H₁₆N₂ ; mW: _{116,21 ) estabiliza los} radicales libres y mejora la polimerización. La velocidad de polimerización y las propiedades del gel resultante dependen de la concentración de radicales libres. Un aumento en la cantidad de radicales libres produce una disminución en la longitud promedio de la cadena polimérica, un aumento en la turbidez del gel y una disminución en su elasticidad. Una disminución en la cantidad produce el efecto contrario. Deben utilizarse las concentraciones catalíticas más bajas que permitan la polimerización en un tiempo razonable. El APS y la TEMED se utilizan normalmente en concentraciones aproximadamente equimolares en el rango de 1 a 10 mM.

Para el procesamiento del gel y de las muestras de proteínas visualizadas en él se utilizan los siguientes productos químicos y procedimientos.

Colorante de seguimiento: Dado que las proteínas y los ácidos nucleicos son en su mayoría incoloros, su movimiento a través del gel durante la electroforesis no se puede seguir fácilmente. Por lo tanto, se suelen incluir colorantes aniónicos de movilidad electroforética conocida en el tampón de muestra de PAGE. Un colorante de seguimiento muy común es el azul de bromofenol (BPB, 3',3",5',5" tetrabromofenolsulfonftaleína). Este colorante se tiñe a pH alcalino y neutro y es una pequeña molécula con carga negativa que se mueve hacia el ánodo . Al ser una molécula altamente móvil, se mueve por delante de la mayoría de las proteínas. Cuando llega al extremo anódico del medio de electroforesis, esta se detiene. Puede unirse débilmente a algunas proteínas y conferirles un color azul. Otros colorantes de seguimiento comunes son el xileno cianol , que tiene menor movilidad, y el Naranja G , que tiene mayor movilidad.

Ayudas de carga: La mayoría de los sistemas PAGE se cargan desde la parte superior hacia los pocillos del gel. Para asegurar que la muestra se deposite en el fondo del pocillo, el tampón de muestra se complementa con aditivos que aumentan la densidad de la muestra. Estos aditivos deben ser no iónicos y no reactivos con las proteínas para evitar interferencias con la electroforesis. Los aditivos comunes son el glicerol y la sacarosa .

El azul brillante de Coomassie _R -250 (CBB) ( _{C₄₅H₄₄N₃NaO₇S₂} ; _{mW : 825,97) es el colorante proteico} más utilizado. Es un colorante aniónico que se une a las proteínas _de forma no específica. Su estructura es predominantemente apolar y se suele utilizar en solución metanólica acidificada con ácido acético. Las proteínas del gel se fijan con ácido acético y se tiñen simultáneamente. El exceso de colorante incorporado al gel se puede eliminar mediante decoloración con la misma solución sin el colorante. Las proteínas se detectan como bandas azules sobre un fondo claro. Dado que el SDS también es aniónico, puede interferir con el proceso de tinción. Por lo tanto, se recomienda un gran volumen de solución de tinción, al menos diez veces el volumen del gel.

El bromuro de etidio (EtBr) es un colorante popular para ácidos nucleicos. El EtBr permite visualizar fácilmente el ADN o el ARN en un gel, ya que emite fluorescencia naranja bajo luz ultravioleta. ^{[ 25 ]} El bromuro de etidio se une a las cadenas de ácidos nucleicos mediante el proceso de intercalación. ^{[ 4 ]} Si bien el bromuro de etidio es un colorante popular, es importante tener precaución al usarlo, ya que es un carcinógeno conocido . Por este motivo, muchos investigadores optan por utilizar colorantes como SYBR Green y SYBR Safe , que son alternativas más seguras al EtBr. ^{[ 26 ]} El EtBr se utiliza simplemente añadiéndolo a la mezcla del gel. Una vez que el gel ha corrido, se puede visualizar mediante un sistema de fotodocumentación. ^{[ 4 ]}

La tinción con plata se utiliza cuando se necesita un método de detección más sensible, ya que la tinción clásica con azul brillante de Coomassie generalmente puede detectar una  banda de proteína de 50 ng, mientras que la tinción con plata aumenta la sensibilidad típicamente de 10 a 100 veces más. Esto se basa en la química del revelado fotográfico. Las proteínas se fijan al gel con una solución diluida de metanol y luego se incuban con una solución ácida de nitrato de plata. Los iones de plata se reducen a su forma metálica por formaldehído a pH alcalino. Una solución ácida, como el ácido acético, detiene el revelado. ^{[ 27 ]} La tinción con plata fue introducida por Kerenyi y Gallyas como un procedimiento sensible para detectar cantidades traza de proteínas en geles. ^{[ 28 ]} La técnica se ha extendido al estudio de otras macromoléculas biológicas que se han separado en una variedad de soportes. ^{[ 29 ]} Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y cada proteína tiene sus propias características de tinción; el material de vidrio limpio, los reactivos puros y el agua de la más alta pureza son los puntos clave para una tinción exitosa. ^{[ 30 ]} La tinción con plata se desarrolló en el siglo XIV para colorear la superficie del vidrio. Se ha utilizado ampliamente con este fin desde el siglo XVI. El color producido por las primeras tinciones de plata variaba entre amarillo claro y rojo anaranjado. Camillo Golgi perfeccionó la tinción con plata para el estudio del sistema nervioso . El método de Golgi tiñe un número limitado de células al azar en su totalidad. ^{[ 31 ]}

La autorradiografía , también utilizada para la detección ^de bandas de proteínas después de la electroforesis en gel, utiliza isótopos radiactivos para marcar las proteínas, que luego se detectan mediante una película de rayos X. [ ^{32 ]}

La transferencia Western es un proceso mediante el cual las proteínas separadas en un gel de acrilamida se transfieren electroforéticamente a una membrana estable y manipulable, como una membrana de nitrocelulosa , nailon o difluoruro de polivinilideno (PVDF). Posteriormente, es posible aplicar técnicas inmunoquímicas para visualizar las proteínas transferidas e identificar con precisión los aumentos o disminuciones relativas de la proteína de interés.