Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Hibridación in situ

Hibridación in situ de ARN : KRT5 y gen de mantenimiento en una sección de tejido de melanoma humano FFPE , visualizado bajo microscopio de campo claro y fluorescencia. Visualiz...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita
Hibridación in situ de ARN : KRT5 y gen de mantenimiento en una sección de tejido de melanoma humano FFPE , visualizado bajo microscopio de campo claro y fluorescencia.
Visualización multiplex de ARN en células mediante ensayos FISH ViewRNA.
Hibridación in situ de embriones de Drosophila de tipo salvaje en diferentes etapas de desarrollo para el ARN de un gen llamado hunchback .
Análisis de la expresión de colágeno en salamandras jóvenes ( P. waltl ) mediante la tecnología de hibridación in situ por fluorescencia de ARN con reacción en cadena de hibridación (HCR RNA-FISH).

La hibridación in situ (ISH) es un tipo de hibridación que utiliza una cadena de ADN , ARN o ácido nucleico modificado y marcado (es decir, una sonda ) para localizar una secuencia específica de ADN o ARN en una porción o sección de tejido ( in situ ) o, si el tejido es lo suficientemente pequeño (por ejemplo, semillas de plantas, embriones de Drosophila ), en todo el tejido (ISH de montaje completo), en células y en células tumorales circulantes (CTC). Esto difiere de la inmunohistoquímica , que generalmente localiza proteínas en secciones de tejido.

La hibridación in situ se utiliza para revelar la ubicación de secuencias específicas de ácidos nucleicos en cromosomas o en tejidos, un paso crucial para comprender la organización, regulación y función de los genes. Las técnicas clave que se utilizan actualmente incluyen la hibridación in situ de ARNm con sondas de oligonucleótidos y ARN (tanto radiomarcadas como marcadas con hapteno), el análisis con microscopios ópticos y electrónicos, la hibridación in situ de preparaciones completas , la detección doble de ARN y ARN más proteína, y la hibridación in situ fluorescente para detectar secuencias cromosómicas. La hibridación in situ de ADN se puede utilizar para determinar la estructura de los cromosomas. La hibridación in situ de ADN fluorescente (FISH) se puede utilizar, por ejemplo, en diagnósticos médicos para evaluar la integridad cromosómica. La hibridación in situ de ARN (RNA ISH ) se utiliza para medir y localizar ARN (ARNm, ARNnc largos y microARN) dentro de secciones de tejido, células, preparaciones completas y células tumorales circulantes (CTC). La hibridación in situ fue inventada por los biólogos estadounidenses Mary-Lou Pardue y Joseph G. Gall . [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]

Desafíos de la hibridación in situ

La hibridación in situ es una técnica poderosa para identificar especies específicas de ARNm dentro de células individuales en secciones de tejido, lo que proporciona información sobre procesos fisiológicos y patogénesis de enfermedades. Sin embargo, la hibridación in situ requiere que se sigan muchos pasos con una optimización precisa para cada tejido examinado y para cada sonda utilizada. Para preservar el ARNm objetivo dentro de los tejidos, a menudo es necesario utilizar fijadores de reticulación (como el formaldehído ). [ 4 ]

Además, la hibridación in situ en secciones de tejido requiere que estas sean muy finas, generalmente de 3 μm a 7 μm de espesor. Los métodos comunes para preparar secciones de tejido para el procesamiento de hibridación in situ incluyen el corte de muestras con un criostato o un cortador de tejido Compresstome . Un criostato toma tejido fresco o fijado y lo sumerge en nitrógeno líquido para su congelación rápida. Luego, el tejido se incrusta en un medio de congelación llamado OCT y se cortan secciones finas. Entre los obstáculos se encuentra la aparición de artefactos de congelación en el tejido que pueden interferir con la tinción adecuada del ARNm. El Compresstome corta el tejido en secciones finas sin un proceso de congelación; las secciones flotantes se cortan después de ser incrustadas en agarosa para su estabilidad. Este método evita la congelación del tejido y, por lo tanto, los artefactos de congelación asociados. El proceso es permanente e irreversible una vez completado. [ 5 ]

Proceso

Para la histoquímica de hibridación , las células y los tejidos de la muestra se tratan habitualmente para fijar los transcritos diana y facilitar el acceso de la sonda. Como se indicó anteriormente, la sonda es un ADN complementario marcado o, actualmente, con mayor frecuencia, un ARN complementario ( ribosonda ). La sonda se hibrida con la secuencia diana a temperatura elevada, y posteriormente se elimina el exceso de sonda mediante lavado (tras una hidrólisis previa con ARNasa en el caso de una sonda de ARN no hibridada). Se pueden manipular parámetros de la solución, como la temperatura, la concentración de sal o detergente, para eliminar cualquier interacción no idéntica (es decir, solo permanecerán unidas las secuencias idénticas). A continuación, la sonda marcada con bases radioactivas, fluorescentes o antigénicas (p. ej., digoxigenina ) se localiza y cuantifica en el tejido mediante autorradiografía , microscopía de fluorescencia o inmunohistoquímica , respectivamente. La ISH también puede utilizar dos o más sondas, marcadas con radiactividad u otros marcadores no radiactivos, para detectar simultáneamente dos o más transcritos.

Una tecnología alternativa, el ensayo de ADN ramificado , puede utilizarse para ensayos de hibridación in situ de ARN (ARNm, ARNnc largo y ARNm pequeño) con sensibilidad de molécula única sin el uso de radiactividad. Este método (por ejemplo, los ensayos ViewRNA) permite visualizar hasta cuatro dianas en un solo ensayo y utiliza un diseño de sonda patentado y amplificación de señal de ADN ramificado para generar señales sensibles y específicas. Las muestras (células, tejidos y CTC) se fijan y luego se tratan para permitir el acceso a la diana de ARN (desenmascaramiento de ARN). Las sondas específicas para cada diana se hibridan con cada ARN diana. La posterior amplificación de la señal se basa en la hibridación específica de sondas adyacentes ( oligonucleótidos individuales [oligos] que se unen lado a lado a las dianas de ARN). Una sonda típica específica para cada diana contiene 40 oligonucleótidos, lo que da como resultado 20 pares de oligos que se unen lado a lado a la diana para la detección de ARNm y ARNnc largo, y 2 oligos o un solo par para la detección de ARNm pequeño. La amplificación de la señal se logra mediante una serie de pasos de hibridación secuenciales. Una molécula preamplificadora se hibrida con cada par de oligonucleótidos del ARN diana específico, y luego múltiples moléculas amplificadoras se hibridan con cada preamplificadora. A continuación, múltiples oligonucleótidos sonda marcados (conjugados con fosfatasa alcalina o directamente con fluoróforos) se hibridan con cada molécula amplificadora. Una estructura de amplificación de señal completamente ensamblada, denominada "Árbol", posee 400 sitios de unión para las sondas marcadas. Cuando todas las sondas específicas se unen al ARNm diana, se produce una amplificación de la señal de 8000 veces para ese transcrito. Sistemas de amplificación de señal independientes pero compatibles permiten realizar ensayos multiplex. La señal se puede visualizar mediante un microscopio de fluorescencia o de campo claro.

Pasos básicos para sondas marcadas con digoxigenina

  1. Permeabilización de las células con proteinasa K para abrir las membranas celulares (alrededor de 25 minutos, no necesaria para secciones de tejido o algunos embriones en etapa temprana).
  2. unión de los ARNm a la sonda de ARN marcada (generalmente durante la noche)
  3. Unión de anticuerpos-fosfatasa a la sonda de ARN (varias horas)
  4. tinción de anticuerpos (por ejemplo, con fosfatasa alcalina )

El protocolo dura entre 2 y 3 días y requiere cierto tiempo de configuración. Algunas empresas venden robots para automatizar el proceso (por ejemplo, CEM InsituPro). Como resultado, se han realizado cribados a gran escala en laboratorios con miles de genes. Los resultados suelen estar disponibles en sitios web (véanse los enlaces externos). [ 6 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ O'Connor, Clare. "Hibridación fluorescente in situ (FISH)" . Nature Education.
  2. ↑ Gall, JG ; Pardue, ML (junio de 1969). "Formación y detección de moléculas híbridas de ARN-ADN en preparaciones citológicas" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 63 (2): 378–83 . Bibcode : 1969PNAS...63..378G . doi : 10.1073/pnas.63.2.378 . PMC 223575. PMID 4895535 .  
  3. ↑ Gall, Joe . "Premio Albert Lasker a la Trayectoria Especial en Ciencias Médicas" . Fundación Lasker.
  4. ↑ Lehmann, Ruth; Tautz, Diethard (1994-01-01), Goldstein, Lawrence SB; Fyrberg, Eric A. (eds.), Capítulo 30 Hibridación in situ al ARN , Métodos en biología celular, vol. 44, Academic Press, pp. 575–598 , doi : 10.1016/s0091-679x(08)60933-4 , ISBN   9780125641456, PMID 7535885 , consultado el 21/02/2021 
  5. ↑ Brown, Lindsay A.; Huntsman, David (1 de mayo de 2007). "Hibridación fluorescente in situ en microarrays de tejido: desafíos y soluciones" . Journal of Molecular Histology . 38 (2): 151– 157. doi : 10.1007/s10735-006-9069-y . ISSN 1567-2387 . PMID 17216303. S2CID 6363208 .   
  6. ↑ Panoskaltsis-Mortari, A.; Bucy, RP (febrero de 1995). "Hibridación in situ con sondas de ARN marcadas con digoxigenina: hechos y artefactos". BioTechniques . 18 (2): 300– 307. ISSN 0736-6205 . PMID 7727134 .  
  1. Jin, L; Lloyd, RV (1997). "Hibridación in situ: métodos y aplicaciones" . Journal of Clinical Laboratory Analysis . 11 (1): 2– 9. doi : 10.1002/(SICI)1098-2825(1997)11:1 < 2::AID-JCLA2 > 3.0.CO ; 2 -F . PMC 6760707. PMID 9021518 .  
  2. Histoquímica de hibridación in situ completa y anotada
  3. La secuenciación de ARN de células tumorales circulantes pancreáticas implica la señalización WNT en la metástasis.
  4. El transcriptoma local en el neuropilo sináptico revelado mediante secuenciación profunda e imágenes de alta resolución.
  • Hibridación in situ en los encabezamientos de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
  • Hibridación in situ de sondas de ARN y miRNA en células, CTC y tejidos.
  • Hibridación in situ de sondas de ARN en tejidos vegetales completos
  • Preparación de conjuntos complejos de sondas de ADN para FISH 3D con hasta seis fluorocromos diferentes.
  • Hibridación in situ de transcripciones de embriones completos para el análisis del fenotipo de Drosophila tratada con ARN de interferencia.
  • bases de datos in situ:
    • Fantasma, factores de transcripción de C. intestinalis
    • expresión génica del pez cebra
    • Expresión del gen MGI GXD en ratones
    • eurexpress Archivado el 13/03/2019 en Wayback Machine