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Detención del ciclo celular inducida

La detención inducida del ciclo celular es el uso de una manipulación química o genética para detener artificialmente la progresión a través del ciclo celular . Los procesos cel...

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La detención inducida del ciclo celular es el uso de una manipulación química o genética para detener artificialmente la progresión a través del ciclo celular . Los procesos celulares como la duplicación del genoma y la división celular se detienen. [ 1 ] Puede ser temporal o permanente. [ 1 ] Es una activación artificial de los puntos de control del ciclo celular que ocurren naturalmente , inducida por estímulos exógenos controlados por un experimentador.

organismos modelo

Algunas detenciones inducidas del ciclo celular se realizan en ovocitos de Xenopus (rana).

En un contexto de investigación académica, la detención del ciclo celular se realiza típicamente en organismos modelo y extractos celulares, como Saccharomyces cerevisiae (levadura) u ovocitos de Xenopus (óvulos de rana). [ 2 ] [ 3 ] Los extractos de óvulos de rana se han utilizado ampliamente en la investigación del ciclo celular porque son relativamente grandes, alcanzan un diámetro de 1 mm, y por lo tanto contienen grandes cantidades de proteína, lo que hace que los niveles de proteína sean más fáciles de medir. [ 4 ]

Propósitos

Existen diversas razones por las que un investigador puede querer impedir, de forma temporal o permanente, el progreso a través del ciclo celular.

Sincronización del ciclo celular

En algunos experimentos, un investigador puede querer controlar y sincronizar el momento en que un grupo de células progresa a la siguiente fase del ciclo celular. [ 5 ] Se puede inducir a las células a detenerse cuando llegan (en diferentes momentos) a una fase determinada, de modo que cuando se levanta la detención (por ejemplo, rescatando la progresión del ciclo celular mediante la introducción de otra sustancia química) todas las células reanudan la progresión del ciclo celular al mismo tiempo. Además de que este método actúa como un control científico para el momento en que las células reanudan el ciclo celular, esto se puede utilizar para investigar la necesidad y la suficiencia .

Otra razón por la que la sincronía es importante es el control de la cantidad de contenido de ADN, que varía en diferentes partes del ciclo celular según si se ha producido replicación del ADN desde la última ronda de mitosis y citocinesis completadas. [ 6 ]

Además, la sincronización de un gran número de células en la misma fase permite recolectar grupos suficientemente grandes de células en el mismo ciclo para su uso en otros ensayos, como Western blot y secuenciación de ARN . [ 7 ]

Reparación del daño del ADN

Es posible que los investigadores estén estudiando los mecanismos de reparación del daño del ADN . Dado que algunos de los mecanismos que se describen a continuación para inducir la detención del ciclo celular implican el daño del ADN, esto permite investigar cómo responde la célula al daño de su material genético. [ 8 ]

Identificación de la función de las proteínas in vivo

La ingeniería genética de células mediante la eliminación de genes específicos también puede dar como resultado células que se detienen en diferentes fases del ciclo celular. Algunos ejemplos son:

  • G 1 : La levadura Saccharomyces cerevisiae que expresa alelos mutantes dominantes de CDC28 se detiene en G 1 , lo que indica que CDC28 es necesario para el paso más allá de la fase G 1. [ 9 ]
  • S: Schizosaccharomyces pombe (levadura de fisión) que expresa una forma mutante termosensible de la ADN polimerasa delta (pol delta ts03) se detiene en la fase S. [ 10 ]
  • G 2 : Levadura de fisión que expresa algunas formas mutantes de CDC2 incapaces de detenerse en G 2 en respuesta al daño del ADN, lo que indica que el producto del gen está involucrado en la detención en G 2. [ 11 ]
  • M: Un cribado de mutantes de levaduras en gemación con detención mitótica identificó a CDC16 , CDC23 y CDC27 como genes clave que, cuando mutan, causan detención en la mitosis. [ 12 ]

Detención en la fase G1

Fases del ciclo celular

La fase G1 es la primera de las cuatro fases del ciclo celular y forma parte de la interfase . Durante la fase G1 , la célula sintetiza ARN mensajero (ARNm) y proteínas en preparación para las etapas posteriores de la interfase que conducen a la mitosis. En las células somáticas humanas , el ciclo celular dura aproximadamente 18 horas, y la fase G1 representa aproximadamente un tercio de ese tiempo. [ 13 ] Por otro lado, en los embriones de rana, erizo de mar y mosca de la fruta , la fase G1 es extremadamente breve y, en cambio , constituye un pequeño intervalo entre la citocinesis y la fase S. [ 13 ]

Factor Alfa

El factor α es una feromona secretada por Saccharomyces cerevisiae que detiene las células de levadura en la fase G1 . Lo hace inhibiendo la enzima adenilato ciclasa . [ 2 ] Esta enzima cataliza la conversión de adenosín trifosfato (ATP) en AMP cíclico 3',5' (AMPc) y pirofosfato . [ 14 ]

inhibición por contacto

La inhibición por contacto es un método para detener el ciclo celular cuando las células vecinas entran en contacto entre sí. Esto da como resultado una monocapa de células detenidas, un proceso que está notablemente ausente en las células cancerosas . El mecanismo sospechado depende de p27 Kip1 , un inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina . [ 15 ] Los niveles de proteína p27 Kip1 se elevan en las células detenidas. Este proceso natural puede imitarse en el laboratorio mediante la sobreexpresión de p27 Kip1 , lo que resulta en una detención inducida del ciclo celular en la fase G1 . [ 16 ]

Mimosina

La mimosina es un aminoácido vegetal que ha demostrado inhibir reversiblemente la progresión más allá de la fase G1 en algunas células humanas, incluidas las células linfoblastoides . [ 5 ] Su mecanismo de acción propuesto es el de un quelante de hierro/zinc que agota el hierro dentro de la célula. Esto induce rupturas de doble cadena en el ADN, inhibiendo la replicación del ADN. Esto podría implicar el bloqueo de la acción de una ribonucleótido reductasa dependiente de hierro . También podría inhibir la transcripción de la serina hidroximetiltransferasa , que depende del zinc. [ 17 ]

Privación de suero

En los cultivos celulares, el suero es el medio de crecimiento en el que se desarrollan las células y contiene nutrientes vitales. Se ha demostrado que la privación de suero —la eliminación parcial o total del suero y sus nutrientes— detiene y sincroniza la progresión del ciclo celular en la fase G0 , por ejemplo, en astrocitos de mamíferos neonatales [ 18 ] y fibroblastos de prepucio humano [ 19 ] .

La privación de aminoácidos es un enfoque similar. Cuando se cultivan en un medio sin algunos aminoácidos esenciales, como la metionina , algunas células se detienen en la fase G1 temprana . [ 5 ]

detención en la fase S

La fase S sigue a la fase G1 a través de la transición G1/S y precede a la fase G2 en la interfase; es la parte del ciclo celular en la que se replica el ADN. Dado que la duplicación precisa del genoma es fundamental para una división celular exitosa, los procesos que ocurren durante la fase S están estrictamente regulados y ampliamente conservados. Los complejos de prereplicación ensamblados antes de la fase S se convierten en horquillas de replicación activas . [ 20 ] Esta conversión está impulsada por Cdc7 y las quinasas dependientes de ciclinas de la fase S , las cuales se regulan positivamente después de la transición G1/S . [ 20 ]

Afidicolina

La afidicolina es un antibiótico aislado del hongo Cephalosporum aphidicola . Es un inhibidor reversible de la replicación del ADN nuclear eucariota que bloquea la progresión más allá de la fase S. Su mecanismo consiste en la inhibición de las ADN polimerasas A y D. Un estudio estructural reveló que se cree que esto ocurre mediante la unión al sitio activo alfa de la polimerasa y la "rotación de la guanina molde", lo que impide la unión del desoxicitidina trifosfato (dCTP) . [ 21 ] Este bloqueo de la fase S induce apoptosis en células HeLa . [ 5 ]

Hidroxiurea

La hidroxiurea (HU) es un fármaco de molécula pequeña que inhibe la enzima ribonucleótido reductasa (RNR), impidiendo la catálisis de la conversión de desoxirribonucleótidos (DNT) en ribonucleótidos . Se postula que existe un radical libre tirosilo dentro de la RNR que es desactivado por la HU. [ 6 ] [ 22 ] Los radicales libres son necesarios para la reducción de los DNT y, en cambio, son eliminados por la HU. [ 23 ] Se ha demostrado que la HU detiene las células tanto en la fase S (células sanas) como inmediatamente antes de la citocinesis (células mutantes). [ 22 ]

2,3-DCPE

El 2,3-(2,3-diclorofenoxi)propil aminoetanol (2,3-DCPE) es una molécula pequeña que induce la detención de la fase S. [ 24 ] Esto se demostró en líneas celulares cancerosas y regula negativamente la expresión del linfoma de células B extra grande ( Bcl-XL ), una proteína antiapoptótica que previene la liberación de contenidos mitocondriales como el citocromo c .

Detención en la fase G2

La fase G2 es la última etapa de la interfase y precede directamente a la mitosis. Las células normales solo entran en ella si la replicación del ADN en la fase S se ha completado con éxito. Es un periodo de rápido crecimiento celular y síntesis de proteínas durante el cual la célula se prepara para la mitosis .

Destrucción del ARNm de la ciclina

Las ciclinas son proteínas que controlan la progresión del ciclo celular mediante la activación de quinasas dependientes de ciclinas. La destrucción del ARN mensajero endógeno de la ciclina puede detener los extractos de óvulos de rana en interfase e impedir que entren en mitosis. [ 3 ] La introducción de ARNm de ciclina exógeno también es suficiente para rescatar la progresión del ciclo celular. [ 3 ] Un método para esta destrucción es mediante el uso de oligonucleótidos antisentido , fragmentos de ARN que se unen al ARNm de la ciclina e impiden que este se traduzca en proteína ciclina. [ 25 ] Esto puede utilizarse para destruir ciclinas específicas de fase más allá de la fase G2 ; por ejemplo, la destrucción del ARNm de la ciclina D1 mediante oligonucleótidos antisentido impide la progresión de la fase G1 a la fase S. [ 26 ]

Detención mitótica

La mitosis es la parte del ciclo celular que no corresponde a la interfase y genera dos células hijas.

La mitosis es la parte final del ciclo celular y sigue a la interfase. Consta de cuatro fases: profase , metafase , anafase y telofase , e implica la condensación de los cromosomas en el núcleo , la disolución de la envoltura nuclear y la separación de las cromátidas hermanas por las fibras del huso . Al concluir la mitosis, las fibras del huso desaparecen y la membrana nuclear se reforma alrededor de cada uno de los dos conjuntos de cromosomas. Tras una mitosis exitosa, la célula se divide físicamente en dos células hijas idénticas en un proceso llamado citocinesis , lo que completa un ciclo celular. Cada una de estas nuevas células podría entonces volver a entrar en la fase G1 y comenzar de nuevo el ciclo celular.

Nocodazol

El nocodazol es un agente químico que interfiere con la polimerización de los microtúbulos. [ 27 ] Las células tratadas con nocodazol se detienen con un contenido de ADN en fase G 2 o M, lo que puede verificarse mediante citometría de flujo. Mediante microscopía se ha determinado que entran en mitosis, pero no pueden formar los husos necesarios para la metafase porque los microtúbulos no pueden polimerizarse. [ 28 ] La investigación sobre el mecanismo ha sugerido que podría impedir que la tubulina forme su heterodímero alfa/beta. [ 29 ]

Taxol

El taxol actúa de forma opuesta al nocodazol, estabilizando el polímero de microtúbulos e impidiendo su desensamblaje. También provoca una detención en la fase M, ya que el huso que debería separar las cromátidas hermanas no puede desensamblarse. [ 30 ] [ 31 ] Actúa a través de un sitio de unión específico en el polímero de microtúbulos y, por lo tanto, no requiere GTP ni otros cofactores para inducir la polimerización de la tubulina. [ 32 ]

Temperatura

Se ha demostrado que la temperatura regula la progresión del ciclo celular de las células HeLa. Se encontró que la mitosis es la parte del ciclo celular más sensible a la temperatura. [ 33 ] La detención mitótica previa a la citocinesis fue visible a través de la acumulación de células en mitosis a temperaturas inferiores a lo normal, entre 24 y 31  °C (75,2-87,8  °F). [ 33 ]

Verificación

Existen varios métodos que pueden utilizarse para verificar que las células se han detenido en la fase adecuada.

Citometría de flujo

La citometría de flujo es una técnica para medir las características físicas y químicas de una población de células mediante láseres y colorantes fluoróforos unidos covalentemente a marcadores proteicos. [ 34 ] Cuanto más fuerte es la señal, mayor es la cantidad de una proteína en particular presente. La tinción con colorantes de ADN , como el yoduro de propidio o el 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), permite delimitar o clasificar las células entre las fases G 1, S o G 2 /M. [ 35 ]

Inmunoblot

La inmunoblotting consiste en la detección de proteínas específicas en una muestra o extracto de tejido. Los anticuerpos primarios reconocen y se unen a la proteína en cuestión, y se añaden anticuerpos secundarios que reconocen los anticuerpos primarios. El anticuerpo secundario se visualiza mediante tinción o inmunofluorescencia , lo que permite la detección indirecta de la proteína diana original.

La inmunoblotting puede utilizarse para detectar la presencia de ciclinas , proteínas que regulan el ciclo celular. [ 36 ] Las distintas clases de ciclinas se regulan al alza y a la baja en diferentes fases del ciclo celular. La medición de las ciclinas en un extracto de una célula detenida permite determinar la fase en la que se encuentra. Por ejemplo, un pico de la proteína ciclina E indicaría la transición G1 /S , un pico de la ciclina A indicaría la fase G2 tardía y un pico de la ciclina B indicaría la mitosis. [ 37 ]

Indicación del ciclo celular basada en la ubiquitinación fluorescente (FUCCI)

FUCCI es un sistema que aprovecha la expresión de proteínas específica de cada fase del ciclo celular y su degradación por la vía ubiquitina-proteasoma . Dos sondas fluorescentes —Cdt1 y Geminin conjugadas a proteínas fluorescentes— permiten la visualización en tiempo real de la fase del ciclo celular en la que se encuentra una célula. [ 38 ]

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