Hispanopedia WikiEl operón de la lactosa ( operón lac ) es un operón necesario para el transporte y el metabolismo de la lactosa en E. coli y muchas otras bacterias entéricas . Aunque la glucosa es la fuente de carbono preferida para la mayoría de las bacterias entéricas, el operón lac permite la digestión eficaz de la lactosa cuando la glucosa no está disponible, mediante la actividad de la β-galactosidasa . [ 1 ] La regulación genética del operón lac fue el primer mecanismo de regulación genética que se comprendió claramente, por lo que se ha convertido en un ejemplo destacado de regulación genética procariota . Por esta razón, se suele tratar en los cursos introductorios de biología molecular y celular . François Jacob y Jacques Monod utilizaron este sistema de metabolismo de la lactosa para determinar cómo una célula biológica sabe qué enzima sintetizar. Su trabajo sobre el operón lac les valió el Premio Nobel de Fisiología en 1965. [ 1 ]
La mayoría de las células bacterianas, incluida la E. coli, carecen de intrones en su genoma. También carecen de membrana nuclear . Por lo tanto, la regulación genética por el operón lac se produce a nivel transcripcional, controlando la transcripción del ADN .
Los operones bacterianos son transcritos policistrónicos capaces de producir múltiples proteínas a partir de un único ARNm . En este caso, cuando la bacteria necesita lactosa como fuente de azúcar , los tres genes del operón lac se transcriben y sus proteínas resultantes se traducen: lacZ , lacY y lacA . El producto génico de lacZ es la β-galactosidasa , que hidroliza la lactosa, un disacárido , en glucosa y galactosa . LacY codifica la β-galactósido permeasa , una proteína de membrana que se inserta en la membrana plasmática para permitir el transporte celular de lactosa al interior de la célula. Finalmente, lacA codifica la β-galactósido transacetilasa .
Tenga en cuenta que el número de pares de bases en el diagrama anterior no está a escala. De hecho, el operón lac contiene más de 5300 pares de bases . [ 2 ]
Sería un desperdicio producir enzimas cuando no hay lactosa disponible o si se dispone de una fuente de energía preferible como la glucosa. El operón lac utiliza un mecanismo de control de dos partes para asegurar que la célula gaste energía en la producción de las enzimas codificadas por el operón lac solo cuando sea necesario. [ 3 ]
En ausencia de lactosa, el represor lac , codificado por lacI, detiene la producción de las enzimas y proteínas transportadoras codificadas por el operón lac . [ 4 ] Lo hace bloqueando la ARN polimerasa dependiente de ADN . Este bloqueo/detención no es perfecto, y se produce una mínima expresión génica de forma continua. La proteína represora siempre se expresa, pero el operón lac (es decir, las enzimas y las proteínas transportadoras) se reprime casi por completo, lo que permite un pequeño nivel de expresión basal. Si no fuera así, no habría proteína transportadora lacY en la membrana celular; por consiguiente, el operón lac no podría detectar la presencia de lactosa.
Cuando hay lactosa disponible pero no glucosa, parte de la lactosa ingresa a la célula mediante una proteína transportadora preexistente codificada por lacY. Esta lactosa se combina con el represor y lo inactiva, permitiendo así la expresión del operón lac . Posteriormente, se sintetiza más β-galactósido permeasa , lo que permite la entrada de aún más lactosa, la cual es digerida por las enzimas codificadas por lacZ y lacA.
Sin embargo, en presencia de glucosa, independientemente de la presencia de lactosa, el operón se reprime. Esto se debe a que la proteína activadora de catabolitos (CAP), necesaria para la producción de las enzimas, permanece inactiva, y EIIA Glc desactiva la permeasa de lactosa para impedir el transporte de lactosa al interior de la célula. Este mecanismo de control dual provoca la utilización secuencial de glucosa y lactosa en dos fases de crecimiento distintas, conocidas como diauxia .
Estructura
- El operón lac consta de 3 genes estructurales , un promotor , un terminador , un regulador y un operador . Los tres genes estructurales son: lacZ , lacY y lacA .
- lacZ codifica la β-galactosidasa (LacZ), una enzima intracelular que escinde el disacárido lactosa en glucosa y galactosa . También participa en la conversión de lactosa en alolactosa (que regula el represor lac ). [ 5 ]
- El gen lacY codifica la β-galactósido permeasa (LacY), un simportador transmembrana que bombea β-galactósidos, incluyendo la lactosa, hacia el interior de la célula utilizando un gradiente de protones en la misma dirección. La permeasa aumenta la permeabilidad de la célula a los β-galactósidos .
- El gen lacA codifica la β-galactósido transacetilasa (LacA), una enzima que transfiere un grupo acetilo del acetil-CoA al tiogalactósido.
Solo lacZ y lacY parecen ser necesarios para la vía catabólica de la lactosa .
En términos numéricos, lacI tiene 1100 pb, lacZ tiene 3000 pb, lacY tiene 800 pb, lacA tiene 800 pb, y 3 pb corresponden a 1 aminoácido. [ 6 ]
Nomenclatura genética
Se utilizan abreviaturas de tres letras para describir fenotipos en bacterias, incluida la E. coli .
Algunos ejemplos son:
- Lac (la capacidad de utilizar la lactosa),
- Su (la capacidad de sintetizar el aminoácido histidina)
- Mot (motilidad natatoria)
- Sm R (resistencia al antibiótico estreptomicina )
En el caso de Lac, las células de tipo silvestre son Lac + y pueden usar la lactosa como fuente de carbono y energía, mientras que los derivados mutantes Lac− no pueden usar la lactosa. Normalmente se usan las mismas tres letras (minúsculas, en cursiva) para etiquetar los genes involucrados en un fenotipo particular, donde cada gen diferente se distingue adicionalmente por una letra extra. Los genes lac que codifican enzimas son lacZ , lacY y lacA . El cuarto gen lac es lacI , que codifica el represor de la lactosa; "I" significa inducibilidad .
Se puede distinguir entre genes estructurales que codifican enzimas y genes reguladores que codifican proteínas que afectan la expresión génica. El uso actual amplía la nomenclatura fenotípica para aplicarla a las proteínas: así, LacZ es el producto proteico del gen lacZ , la β-galactosidasa. Varias secuencias cortas que no son genes también afectan la expresión génica, incluyendo el promotor lac , lac p , y el operador lac , lac o . Aunque no es un uso estrictamente estándar, las mutaciones que afectan a lac o se denominan lac o c , por razones históricas.
Regulación
El control específico de los genes lac depende de la disponibilidad del sustrato lactosa para la bacteria. Las proteínas no son producidas por la bacteria cuando la lactosa no está disponible como fuente de carbono. Los genes lac están organizados en un operón ; es decir, están orientados en la misma dirección inmediatamente adyacentes en el cromosoma y se cotranscriben en una única molécula de ARNm policistrónico . La transcripción de todos los genes comienza con la unión de la enzima ARN polimerasa (RNAP), una proteína de unión al ADN , que se une a un sitio de unión al ADN específico, el promotor , inmediatamente corriente arriba de los genes. La unión de la ARN polimerasa al promotor es facilitada por la proteína activadora de catabolitos unida a cAMP (CAP, también conocida como proteína receptora de cAMP). [ 7 ] Sin embargo, el gen lacI (gen regulador del operón lac ) produce una proteína que bloquea la unión de la RNAP al operador del operón. Esta proteína solo puede eliminarse cuando la alolactosa se une a ella y la inactiva. La proteína que se forma a partir del gen lacI se conoce como represor lac. El tipo de regulación que sufre el operón lac se denomina inducible negativa, lo que significa que el gen se desactiva por el factor regulador ( represor lac ) a menos que se añada alguna molécula (lactosa). Una vez eliminado el represor, la ARN polimerasa procede a transcribir los tres genes ( lacZYA ) en ARNm. Cada uno de los tres genes en la cadena de ARNm tiene su propia secuencia de Shine-Dalgarno , por lo que los genes se traducen de forma independiente. [ 8 ] La secuencia de ADN del operón lac de E. coli , el ARNm lacZYA y los genes lacI están disponibles en GenBank (ver) .
El primer mecanismo de control es la respuesta reguladora a la lactosa, que utiliza una proteína reguladora intracelular llamada represor de la lactosa para inhibir la producción de β-galactosidasa en ausencia de lactosa. El gen lacI , que codifica el represor, se encuentra cerca del operón lac y se expresa siempre ( constitutivamente ). Si falta lactosa en el medio de cultivo, el represor se une fuertemente a una secuencia corta de ADN justo después del promotor, cerca del inicio de lacZ, llamada operador lac . La unión del represor al operador interfiere con la unión de la ARN polimerasa al promotor, por lo que el ARNm que codifica LacZ y LacY se produce en niveles muy bajos. Sin embargo, cuando las células se cultivan en presencia de lactosa, un metabolito de la lactosa llamado alolactosa, producido a partir de la lactosa por el producto del gen lacZ , se une al represor, provocando un cambio alostérico. Al estar alterado, el represor no puede unirse al operador, lo que permite que la ARN polimerasa transcriba los genes lac y, por lo tanto, produce niveles más altos de las proteínas codificadas.
El segundo mecanismo de control es una respuesta a la glucosa, que utiliza el homodímero de la proteína activadora de catabolitos (CAP) para aumentar considerablemente la producción de β-galactosidasa en ausencia de glucosa. El monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) es una molécula señalizadora cuya prevalencia es inversamente proporcional a la de la glucosa. Se une a la CAP, lo que a su vez permite que la CAP se una al sitio de unión de la CAP (una secuencia de ADN de 16 pb corriente arriba del promotor a la izquierda en el diagrama inferior, aproximadamente 60 pb corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción), [ 9 ] lo que ayuda a la ARN polimerasa a unirse al ADN. En ausencia de glucosa, la concentración de AMPc es alta y la unión de CAP-AMPc al ADN aumenta significativamente la producción de β-galactosidasa, lo que permite a la célula hidrolizar la lactosa y liberar galactosa y glucosa.
Más recientemente, se demostró que la exclusión del inductor bloquea la expresión del operón lac cuando hay glucosa presente. La glucosa se transporta al interior de la célula mediante el sistema de fosfotransferasa dependiente de PEP . El grupo fosfato del fosfoenolpiruvato se transfiere a través de una cascada de fosforilación que consta de las proteínas generales del sistema de fosfotransferasa (PTS) HPr y EIA, y las proteínas específicas de glucosa EIIA Glc y EIIB Glc , el dominio citoplasmático del transportador de glucosa EII. El transporte de glucosa va acompañado de su fosforilación por EIIB Glc , lo que elimina el grupo fosfato de las otras proteínas del PTS, incluida EIIA Glc . La forma no fosforilada de EIIA Glc se une a la permeasa lac e impide que introduzca lactosa en la célula. Por lo tanto, si hay glucosa y lactosa presentes, el transporte de glucosa bloquea el transporte del inductor del operón lac . [ 10 ]
Estructura represora
El represor lac es una proteína de cuatro partes, un tetrámero, con subunidades idénticas. Cada subunidad contiene un motivo hélice-giro-hélice (HTH) capaz de unirse al ADN. El sitio operador, donde se une el represor, es una secuencia de ADN con simetría de repetición invertida. Los dos semisitios de ADN del operador se unen a dos de las subunidades del represor. Si bien las otras dos subunidades del represor no desempeñan ninguna función en este modelo, esta propiedad permaneció sin comprender durante muchos años.
Finalmente se descubrió que dos operadores adicionales participan en la regulación de lac . [ 11 ] Uno (O 3 ) se encuentra aproximadamente -90 pb corriente arriba de O 1 en el extremo del gen lacI , y el otro (O 2 ) está aproximadamente +410 pb corriente abajo de O 1 en la parte inicial de lacZ . Estos dos sitios no se encontraron en los trabajos iniciales porque tienen funciones redundantes y las mutaciones individuales no afectan mucho la represión. Las mutaciones únicas en O 2 o O 3 tienen efectos de solo 2 a 3 veces. Sin embargo, su importancia se demuestra por el hecho de que un mutante doble defectuoso en O 2 y O 3 se desreprime drásticamente (aproximadamente 70 veces).
En el modelo actual, el represor lac se une simultáneamente al operador principal O1 y a O2 o O3 . El ADN intermedio forma un bucle que se desprende del complejo. La redundancia de los dos operadores menores sugiere que no es un complejo en bucle específico el que resulta importante. Una hipótesis plantea que el sistema funciona mediante anclaje; si el represor unido se libera momentáneamente de O1 , su unión a un operador menor lo mantiene cerca, permitiéndole volver a unirse rápidamente. Esto aumentaría la afinidad del represor por O1 .
Mecanismo de inducción
El represor es una proteína alostérica , es decir, puede adoptar dos formas ligeramente diferentes que se encuentran en equilibrio entre sí. En una forma, el represor se une al ADN operador con alta especificidad, y en la otra, pierde dicha especificidad. Según el modelo clásico de inducción, la unión del inductor, ya sea alolactosa o IPTG, al represor afecta la distribución del represor entre las dos formas. Así, el represor unido al inductor se estabiliza en la conformación que no se une al ADN. Sin embargo, este modelo simple no lo explica todo, ya que el represor se une de forma bastante estable al ADN, pero se libera rápidamente al añadir el inductor. Por lo tanto, parece claro que un inductor también puede unirse al represor cuando este ya está unido al ADN. Aún se desconoce por completo el mecanismo exacto de unión. [ 12 ]
Función de la unión no específica
La unión no específica del represor al ADN desempeña un papel crucial en la represión e inducción del operón Lac. El sitio de unión específico para la proteína represora Lac es el operador. La interacción no específica está mediada principalmente por interacciones carga-carga, mientras que la unión al operador se refuerza mediante interacciones hidrofóbicas. Además, existe una gran cantidad de secuencias de ADN no específicas a las que el represor puede unirse. En esencia, cualquier secuencia que no sea el operador se considera no específica. Los estudios han demostrado que, sin la presencia de unión no específica, la inducción (o desrepresión) del operón Lac no podría ocurrir incluso con niveles saturados de inductor. Se ha demostrado que, sin unión no específica, el nivel basal de inducción es diez mil veces menor que el observado normalmente. Esto se debe a que el ADN no específico actúa como una especie de "sumidero" para las proteínas represoras, desviándolas del operador. Las secuencias no específicas disminuyen la cantidad de represor disponible en la célula. Esto a su vez reduce la cantidad de inductor necesaria para desreprimir el sistema. [ 13 ]
análogos de la lactosa
Se han descrito varios derivados o análogos de la lactosa que resultan útiles para trabajar con el operón lac . Estos compuestos son principalmente galactósidos sustituidos, en los que la porción de glucosa de la lactosa se reemplaza por otro grupo químico.
- El isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) se utiliza frecuentemente como inductor del operón lac para trabajos fisiológicos. El IPTG se une al represor y lo inactiva, pero no es un sustrato para la β-galactosidasa. Una ventaja del IPTG para estudios in vivo es que, dado que no puede ser metabolizado por E. coli , su concentración permanece constante y la tasa de expresión de los genes controlados por lac p/o no es una variable en el experimento. La ingesta de IPTG depende de la acción de la lactosa permeasa en P. fluorescens , pero no en E. coli . [ 14 ]
- La fenil-β-D-galactosa (fenil-Gal) es un sustrato para la β-galactosidasa, pero no inactiva al represor y, por lo tanto, no es un inductor. Dado que las células de tipo silvestre producen muy poca β-galactosidasa, no pueden crecer utilizando fenil-Gal como fuente de carbono y energía. Los mutantes que carecen de represor pueden crecer en fenil-Gal. Por lo tanto, un medio mínimo que contenga solo fenil-Gal como fuente de carbono y energía es selectivo para mutantes del represor y mutantes del operador. Si se siembran 10⁸ células de una cepa de tipo silvestre en placas de agar que contienen fenil-Gal, las escasas colonias que crecen son principalmente mutantes espontáneos que afectan al represor. La distribución relativa de mutantes del represor y del operador se ve afectada por el tamaño del objetivo. Dado que el gen lacI que codifica el represor es aproximadamente 50 veces mayor que el operador, los mutantes del represor predominan en la selección.
- El tiometil galactósido [TMG] es otro análogo de la lactosa. Estos inhiben el represor lacI. A bajas concentraciones del inductor, tanto el TMG como el IPTG pueden entrar en la célula a través de la permeasa de la lactosa. Sin embargo, a altas concentraciones del inductor, ambos análogos pueden entrar en la célula de forma independiente. El TMG puede reducir las tasas de crecimiento a altas concentraciones extracelulares. [ 15 ]
- Otros compuestos sirven como indicadores coloridos de la actividad de la β-galactosidasa.
- El ONPG se escinde para producir el compuesto intensamente amarillo, ortonitrofenol y galactosa, y se usa comúnmente como sustrato para el ensayo de β-galactosidasa in vitro . [ 16 ]
- Las colonias que producen β-galactosidasa se vuelven azules por acción del X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido), un sustrato artificial para la β-galactosidasa cuya escisión produce galactosa e índigo 4-Cl,3-Br, generando así un color azul intenso. [ 17 ]
- La alolactosa es un isómero de la lactosa y es el inductor del operón lac . La lactosa es galactosa-β(1→4)-glucosa, mientras que la alolactosa es galactosa-β(1→6)-glucosa. La lactosa se convierte en alolactosa mediante la β-galactosidasa en una reacción alternativa a la hidrolítica. Un experimento fisiológico que demuestra el papel de LacZ en la producción del inductor "verdadero" en células de E. coli es la observación de que un mutante nulo de lacZ aún puede producir la permeasa LacY cuando se cultiva con IPTG, un análogo no hidrolizable de la alolactosa, pero no cuando se cultiva con lactosa. La explicación es que el procesamiento de la lactosa a alolactosa (catalizado por la β-galactosidasa) es necesario para producir el inductor dentro de la célula.
Desarrollo del modelo clásico
El microorganismo experimental utilizado por François Jacob y Jacques Monod fue la bacteria común de laboratorio, E. coli , pero muchos de los conceptos reguladores básicos que descubrieron Jacob y Monod son fundamentales para la regulación celular en todos los organismos. [ 18 ] La idea clave es que las proteínas no se sintetizan cuando no son necesarias: E. coli conserva recursos celulares y energía al no producir las tres proteínas Lac cuando no hay necesidad de metabolizar la lactosa, como cuando hay otros azúcares disponibles, como la glucosa . La siguiente sección analiza cómo E. coli controla ciertos genes en respuesta a las necesidades metabólicas.
Durante la Segunda Guerra Mundial , Monod estaba probando los efectos de combinaciones de azúcares como fuentes de nutrientes para E. coli y B. subtilis . Monod estaba dando seguimiento a estudios similares que otros científicos habían realizado con bacterias y levaduras. Descubrió que las bacterias cultivadas con dos azúcares diferentes a menudo presentaban dos fases de crecimiento. Por ejemplo, si se proporcionaban glucosa y lactosa, la glucosa se metabolizaba primero (fase de crecimiento I, véase la Figura 2) y luego la lactosa (fase de crecimiento II). La lactosa no se metabolizaba durante la primera parte de la curva de crecimiento diaúxico porque no se producía β-galactosidasa cuando tanto la glucosa como la lactosa estaban presentes en el medio. Monod denominó a este fenómeno diauxia . [ 19 ]
Monod luego centró su atención en la inducción de la formación de β-galactosidasa que ocurría cuando la lactosa era el único azúcar en el medio de cultivo. [ 20 ]
Clasificación de mutantes reguladores
Un avance conceptual de Jacob y Monod [ 21 ] fue reconocer la distinción entre sustancias reguladoras y los sitios donde actúan para modificar la expresión génica. Jacob, exsoldado, utilizó la analogía de un bombardero que liberaría su carga letal al recibir una transmisión o señal de radio específica. Un sistema que funcione requiere tanto un transmisor terrestre como un receptor en el avión. Ahora bien, supongamos que el transmisor habitual está averiado. Este sistema puede volver a funcionar introduciendo un segundo transmisor funcional. En cambio, dijo, consideremos un bombardero con un receptor defectuoso. El comportamiento de este bombardero no puede modificarse introduciendo un segundo avión funcional.
Para analizar mutantes reguladores del operón lac , Jacob desarrolló un sistema que permitía introducir una segunda copia de los genes lac ( lacI con su promotor y lacZYA con promotor y operador) en una sola célula. Posteriormente, se analiza el fenotipo regulador en un cultivo de estas bacterias, que son diploides para los genes lac pero por lo demás normales. En particular, se determina si LacZ y LacY se producen incluso en ausencia de IPTG (debido a que el represor de la lactosa producido por el gen mutante no es funcional). Este experimento, en el que se analizan genes o grupos de genes por pares, se denomina prueba de complementación .
Esta prueba se ilustra en la figura ( lacA se omite por simplicidad). Primero, se muestran ciertos estados haploides (es decir, la célula contiene solo una copia de los genes lac ). El panel (a) muestra la represión, (b) muestra la inducción por IPTG, y (c) y (d) muestran el efecto de una mutación en el gen lacI o en el operador, respectivamente. En el panel (e) se muestra la prueba de complementación para el represor. Si una copia de los genes lac contiene una mutación en lacI , pero la segunda copia es de tipo silvestre para lacI , el fenotipo resultante es normal, pero lacZ se expresa cuando se expone al inductor IPTG. Se dice que las mutaciones que afectan al represor son recesivas respecto al tipo silvestre (y que el tipo silvestre es dominante ), y esto se explica por el hecho de que el represor es una proteína pequeña que puede difundirse en la célula. La copia del operón lac adyacente al gen lacI defectuoso se desactiva efectivamente por la proteína producida a partir de la segunda copia de lacI .
Si se realiza el mismo experimento utilizando una mutación en el operador, se obtiene un resultado diferente (panel (f)). El fenotipo de una célula que porta un sitio operador mutante y otro de tipo silvestre es que LacZ y LacY se producen incluso en ausencia del inductor IPTG; esto se debe a que el sitio operador dañado no permite la unión del represor para inhibir la transcripción de los genes estructurales. La mutación en el operador es dominante. Cuando el sitio operador donde debe unirse el represor está dañado por una mutación, la presencia de un segundo sitio funcional en la misma célula no afecta la expresión de los genes controlados por el sitio mutante.
Una versión más sofisticada de este experimento utiliza operones marcados para distinguir entre las dos copias de los genes lac y demostrar que el gen o los genes estructurales no regulados son los que se encuentran junto al operador mutante (panel (g)). Por ejemplo, supongamos que una copia está marcada por una mutación que inactiva lacZ , de modo que solo puede producir la proteína LacY, mientras que la segunda copia lleva una mutación que afecta a lacY y solo puede producir LacZ. En esta versión, solo la copia del operón lac adyacente al operador mutante se expresa sin IPTG. Decimos que la mutación del operador es cis-dominante ; es dominante sobre el tipo silvestre, pero afecta solo a la copia del operón inmediatamente adyacente.
Esta explicación resulta engañosa en un sentido importante, ya que parte de la descripción del experimento y luego explica los resultados en términos de un modelo. Sin embargo, en realidad, suele ser cierto que el modelo precede al experimento, el cual se diseña específicamente para ponerlo a prueba. Jacob y Monod concibieron inicialmente la existencia de un sitio en el ADN con las propiedades del operador, y posteriormente diseñaron sus pruebas de complementación para demostrarlo.
La dominancia de los mutantes del operador también sugiere un procedimiento para seleccionarlos específicamente. Si se seleccionan mutantes reguladores a partir de un cultivo de tipo silvestre utilizando fenil-Gal, como se describió anteriormente, las mutaciones del operador son raras en comparación con las mutaciones del represor debido al pequeño tamaño del objetivo. Pero si en cambio partimos de una cepa que contiene dos copias de toda la región lac (es decir, diploide para lac ), las mutaciones del represor (que aún ocurren) no se recuperan porque la complementación por el segundo gen lacI de tipo silvestre confiere un fenotipo de tipo silvestre. Por el contrario, la mutación de una copia del operador confiere un fenotipo mutante porque es dominante sobre la segunda copia de tipo silvestre.
Regulación por AMP cíclico
Fuente: [ 22 ]
La explicación de la diauxia dependía de la caracterización de mutaciones adicionales que afectaban a los genes lac, distintas de las explicadas por el modelo clásico. Posteriormente, se identificaron otros dos genes, cya y crp , que se localizaban lejos de lac y que, al mutar, provocaban una disminución de la expresión en presencia de IPTG e incluso en cepas de la bacteria que carecían del represor o del operador. El descubrimiento del AMPc en E. coli permitió demostrar que los mutantes con defectos en el gen cya , pero no en el gen crp , podían recuperar su actividad completa mediante la adición de AMPc al medio.
El gen cya codifica la adenilato ciclasa, que produce AMPc. En un mutante cya , la ausencia de AMPc hace que la expresión de los genes lacZYA sea más de diez veces menor que la normal. La adición de AMPc corrige la baja expresión de Lac característica de los mutantes cya . El segundo gen, crp , codifica una proteína llamada proteína activadora de catabolitos (CAP) o proteína receptora de AMPc (CRP). [ 23 ]
Sin embargo, las enzimas del metabolismo de la lactosa se producen en pequeñas cantidades en presencia de glucosa y lactosa (a veces denominado expresión residual), debido a que la ARN polimerasa puede unirse e iniciar la transcripción incluso en ausencia de la proteína CAP. La expresión residual es necesaria para permitir el metabolismo de cierta cantidad de lactosa una vez agotada la glucosa, pero antes de que la expresión del gen lac se active por completo.
En resumen:
- Cuando no hay lactosa, la producción de la enzima Lac es muy baja (el operador tiene unido el represor Lac).
- Cuando hay lactosa presente, pero también hay una fuente de carbono preferida (como la glucosa), se produce una pequeña cantidad de enzima (el represor Lac no está unido al operador).
- En ausencia de glucosa, el CAP-cAMP se une a un sitio específico del ADN situado corriente arriba del promotor y establece una interacción directa proteína-proteína con la ARN polimerasa, lo que facilita la unión de la ARN polimerasa al promotor.
El retraso entre las fases de crecimiento refleja el tiempo necesario para producir cantidades suficientes de enzimas metabolizadoras de lactosa. Primero, la proteína reguladora CAP debe ensamblarse en el promotor lac , lo que resulta en un aumento en la producción de ARNm lac . Más copias disponibles del ARNm lac resultan en la producción (ver traducción ) de copias significativamente más numerosas de LacZ (β-galactosidasa, para el metabolismo de la lactosa) y LacY (lactosa permeasa para transportar la lactosa al interior de la célula). Después de un retraso necesario para aumentar el nivel de las enzimas metabolizadoras de lactosa, las bacterias entran en una nueva fase rápida de crecimiento celular .
Dos interrogantes sobre la represión catabólica se relacionan con la forma en que los niveles de AMPc se acoplan a la presencia de glucosa y, en segundo lugar, por qué las células se molestan en hacerlo. Tras la hidrólisis de la lactosa, se forman glucosa y galactosa (que se convierte fácilmente en glucosa). En términos metabólicos, la lactosa es una fuente de carbono y energía tan buena como la glucosa. El nivel de AMPc no se relaciona con la concentración intracelular de glucosa, sino con la velocidad de transporte de glucosa, que influye en la actividad de la adenilato ciclasa. (Además, el transporte de glucosa también conduce a la inhibición directa de la lactosa permeasa). En cuanto a por qué E. coli funciona de esta manera, solo se puede especular. Todas las bacterias entéricas fermentan la glucosa, lo que sugiere que la encuentran con frecuencia. Es posible que una pequeña diferencia en la eficiencia del transporte o metabolismo de la glucosa frente a la lactosa haga ventajoso para las células regular el operón lac de esta forma. [ 24 ]
Uso en biología molecular
El gen lac y sus derivados son adecuados para su uso como gen reportero en varias técnicas de selección bacterianas, como el análisis de doble híbrido , en el que se debe determinar la unión exitosa de un activador transcripcional a una secuencia promotora específica. [ 17 ] En placas LB que contienen X-gal , el cambio de color de colonias blancas a un tono azul corresponde a aproximadamente 20–100 unidades de β-galactosidasa, mientras que los medios de lactosa de tetrazolio y lactosa de MacConkey tienen un rango de 100–1000 unidades, siendo más sensibles en las partes alta y baja de este rango, respectivamente. [ 17 ] Dado que los medios de lactosa de MacConkey y lactosa de tetrazolio dependen de los productos de la degradación de la lactosa, requieren la presencia de los genes lacZ y lacY . Por lo tanto, las numerosas técnicas de fusión lac que incluyen solo el gen lacZ son adecuadas para placas de X-gal [ 17 ] o caldos líquidos ONPG . [ 25 ]
Véase también
Referencias
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Enlaces externos
- Lac+Operon en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
- operón lac en la biblioteca de NCBI
- Colección de animación virtual : Presentamos el operón Lac .
- El operón ' lac : Ciencia de Bozeman
- Tinción de embriones completos de ratón para detectar la actividad de la β-galactosidasa (lacZ).
- Explicación del modelo del operón lac
- expresión génica
- Genética bacteriana
- Operones
- Lactosa
