Laura Manuelidis

Al principio de su carrera, Manuelidis descubrió importantes motivos de secuencias de ADN desconocidos y demostró su organización de megabases en cromosomas metafásicos y núcleos interfásicos . Utilizando enzimas de restricción en ADN humano completo y extrayendo bandas de gel específicas, un enfoque que nadie había utilizado previamente para genomas de mamíferos completos, descubrió secuencias de ADN repetidas complejas humanas (satélite α) y las localizó en los centrómeros . ^{[ 5 ] [ 6 ]} Eran homólogas a las repeticiones centroméricas de simios, pero no a las más simples del ratón. ^{[ 7 ]} Estas secuencias de replicación tardía, que contienen pocos genes, o ninguno, definen todos los centrómeros de los cromosomas humanos, como lo demuestra el desarrollo de la hibridación in situ de alta resolución . ^{[ 8 ]}

Al igual que en otras células de mamíferos, los centrómeros son fundamentales para la correcta segregación de los cromosomas entre dos nuevas células hijas durante la mitosis , y el descubrimiento y la localización de estas secuencias satélite han facilitado el diagnóstico de la trisomía y las aberraciones cromosómicas en enfermedades genéticas y tumores.

Manuelidis también descubrió, aisló y secuenció las repeticiones L1 intercaladas largas humanas ( LINES ) y demostró que contenían un marco de lectura abierto transcripcional . ^{[ 9 ]} Encontró que estas abundantes repeticiones L1 se concentraban en bandas oscuras de Giemsa en los brazos cromosómicos que contienen muchos genes específicos de tejido, ^{[ 10 ]} mientras que las repeticiones cortas ALU se concentran en bandas claras con la mayoría de los genes de mantenimiento celular .

Las repeticiones L1 se conservan en la evolución y muestran un 70 % de homología con las repeticiones L1 del ratón. Tras la secuenciación del VIH retroviral , otros dedujeron que las repeticiones L1 eran retrovirales. Quedó claro que estos antiguos y grandes invasores retrovirales entraron en el genoma y fueron transfigurados simbióticamente, o domesticados patológicamente, durante la evolución para adquirir un papel estructural, y posiblemente funcional, en dominios de bandas cromosómicas de megabases. El enorme tamaño de los dominios ricos en L1 y ALU también se demostró mediante electroforesis de campo pulsado . ^{[ 11 ]}

Otros ADN retrovirales endógenos , como los que producen partículas A intracisternales retrovirales (IAP) en roedores, así como repeticiones retrovirales endógenas humanas menos numerosas, también se integran en ubicaciones cromosómicas específicas. ^{[ 12 ]} Esto socava aún más la suposición de que los ADN repetidos son "basura" parasitaria.

Manuelidis también abrió el campo de la estructura cromosómica tridimensional en el núcleo interfásico de células diferenciadas al combinar secciones seriadas ópticas e hibridación in situ de alta resolución de secuencias de ADN específicas. Estos estudios transformaron drásticamente la imagen de los núcleos interfásicos. Anteriormente, los compartimentos interfásicos se veían como masas heterocromáticas densas mal definidas junto a espaguetis de cromatina eucromática desorganizados sin una estructura tridimensional cohesiva. En neuronas diferenciadas se demostraron patrones muy distintos de posiciones individuales del centrómero para cada subtipo neuronal. Estas posiciones se conservan en la evolución a pesar de que las repeticiones de ADN centromérico son específicas de la especie. ^{[ 13 ]} Al trazar el movimiento del cromosoma X en neuronas grandes en la epilepsia, ^{[ 14 ]} y el movimiento de los centrómeros durante el desarrollo neuronal postmitótico, ^{[ 15 ]} se iluminaron los cambios dinámicos de los cromosomas grandes. El mapeo de alta resolución de cromosomas humanos individuales completos en células humanas híbridas de ratón y hámster mostró además que cada cromosoma era compacto y ocupaba su propio espacio individual o "territorio". ^{[ 16 ] [ 17 ]}

Un modelo arquitectónico de los cromosomas durante su transición de metafase a interfase se ajusta a la compactación del ADN conocida en células diploides y permite transiciones y segregación rápidas durante la mitosis, así como extensiones locales que acomodan la transcripción. ^{[ 18 ]} El mapeo de cromosomas individuales completos mediante hibridación de ADN de alta resolución de bibliotecas específicas de cromosomas desarrolladas aquí ^{[ 19 ] [ 20 ]} fue posteriormente útil para resolver cambios cromosómicos en enfermedades genéticas complejas y progresión tumoral . Finalmente, la inserción de un enorme transgén de 11 megabases del exón de globina (sin intrones ) fue reconocida por las células y silenciada por compactación junto con centrómeros heterocromáticos transcripcionalmente inertes en neuronas. ^{[ 21 ]} Esto demuestra que las repeticiones ininterrumpidas son capaces de inducir cambios funcionales y estructurales específicos durante la interfase. Es probable que esta característica opere secuencialmente durante la diferenciación celular.

El laboratorio de EE Manuelidis y L Manuelidis fue el primero en transmitir en serie la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) humana a cobayas y pequeños roedores. ^{[ 22 ] [ 23 ] [ 24 ]} Esto permitió demostrar mecanismos fundamentales de infección, incluyendo la captación y propagación del agente de la EET a través de células mieloides de la sangre, ^{[ 25 ] [ 26 ]} una ruta común para la mayoría de los virus. La falta de transmisión materna de la ECJ esporádica (ECJs) en cobayas longevas, ^{[ 27 ]} contrasta con la herencia de la línea germinal propuesta para la ECJs. Al igual que con los virus, las diferentes especies varían en su susceptibilidad a cepas específicas del agente de la EET. Las principales distinciones de cepas del agente con respecto al scrapie están codificadas por diferentes agentes de la EET humana, como la ECJs, el kuru de Nueva Guinea, ^{[ 28 ]} la vECJ ligada a bovinos, ^{[ 29 ]} y la ECJ asiática. Estos hallazgos se descubrieron y documentaron mediante transmisiones experimentales a ratones, hámsteres y cultivos celulares monotípicos en Yale. Las bandas de proteína priónica no permiten distinguir cepas de EET muy diferentes en cerebros de ratones estándar.

Manuelidis y sus colegas fueron los primeros en demostrar que la proteína priónica amiloide se derivaba de una proteína precursora glicosilada de 34 kDa utilizando lectinas. Los anticuerpos PrP y las lectinas seleccionadas se unieron a la misma proteína tanto en fracciones cerebrales normales como infectadas con ECJ y scrapie. ^{[ 30 ]} Además, la secuencia de azúcares correcta de PrP se demostró por primera vez en el laboratorio de Manuelidis mediante la desglucosilación secuencial y el desenmascaramiento de los residuos de azúcar. ^{[ 31 ]} Manuelidis y sus colegas también desarrollaron cultivos celulares monotípicos infectados por muchas cepas diferentes de EET de scrapie humano y ovino, y desarrollaron ensayos cuantitativos rápidos de títulos infecciosos de 1 millón de veces o más para cada cepa. ^{[ 32 ]} Al igual que en el cerebro, las cantidades de PrP mal plegada muestran un aumento de menos de 5 veces y ni siquiera pudieron distinguir diferencias de más de 100 veces en la infectividad de las cepas del agente cultivadas. Estos estudios de cultivo demostraron además que los patrones de bandas de PrP dependen del tipo de célula. Solo cepas raras muestran un patrón de plegamiento de PrP distintivo en el cerebro o en células monotípicas, y un cambio en las bandas de PrP no induce ningún cambio en las características de la cepa. ^{[ 33 ]} Además, las cepas de EET modifican la replicación de otras de forma similar a un virus. Experimentos en ratones y células neuronales hipotalámicas GT en cultivo muestran infectividad tanto inhibitoria como aditiva por dos cepas diferentes de EET: una cepa de EET puede inhibir la replicación de una segunda cepa más virulenta ^{[ 34 ]} mientras que dos cepas diferentes pueden infectar células simultáneamente. ^{[ 35 ]}

Finalmente, se documentaron cambios drásticos en el tiempo de duplicación del agente (de semanas a un día) para muchas cepas de EET. Los agentes de EET se replican cada 24 horas en cultivo, en marcado contraste con su replicación muy lenta y específica de la cepa en el cerebro. Esta rápida replicación del agente en cultivo probablemente se deba a la liberación de las restricciones del agente por parte del complejo sistema inmunitario del huésped en los animales. ^{[ 32 ]} Estas incluyen respuestas microgliales tempranas. ^{[ 36 ] [ 37 ] [ 38 ]} El amiloide PrP en sí mismo también puede comportarse como una respuesta inmunitaria innata defensiva a la infección por el agente de EET, y los altos niveles de amiloide PrP pueden abolir el 99,999% de la infectividad. ^{[ 39 ] [ 40 ]}