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Ensayo de unión de ligando

Un ensayo de unión de ligando ( LBA ) es un ensayo o procedimiento analítico que se basa en la unión de moléculas de ligando a receptores , anticuerpos u otras macromoléculas . ...

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Un ensayo de unión de ligando ( LBA ) es un ensayo o procedimiento analítico que se basa en la unión de moléculas de ligando a receptores , anticuerpos u otras macromoléculas . [ 1 ] Se utiliza un método de detección para determinar la presencia y la cantidad de los complejos ligando-receptor formados, y esto generalmente se determina electroquímicamente o mediante un método de detección de fluorescencia . [ 2 ] Este tipo de prueba analítica se puede utilizar para detectar la presencia de moléculas objetivo en una muestra que se sabe que se unen al receptor. [ 3 ]

Existen numerosos tipos de ensayos de unión de ligandos, tanto radiactivos como no radiactivos. [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] Algunos tipos más recientes se denominan ensayos de "mezcla y medición" porque requieren menos pasos para completarse, por ejemplo, al prescindir de la eliminación de reactivos no unidos. [ 5 ]

Los ensayos de unión de ligandos se utilizan principalmente en farmacología para diversas aplicaciones. En concreto, a pesar de los receptores endógenos , las hormonas y otros neurotransmisores del cuerpo humano , los farmacólogos emplean estos ensayos para crear fármacos selectivos o que imiten los componentes celulares endógenos. Por otro lado, estas técnicas también se utilizan para crear antagonistas de receptores con el fin de prevenir cascadas de reacciones. [ 7 ] Estos avances permiten a los investigadores no solo cuantificar hormonas y receptores hormonales, sino también aportar información farmacológica importante para el desarrollo de fármacos y planes de tratamiento. [ 8 ]

Historia

Históricamente, las técnicas de ensayo de unión de ligandos se utilizaron ampliamente para cuantificar las concentraciones de hormonas o receptores hormonales en plasma o en tejido. La metodología del ensayo de unión de ligandos cuantificaba la concentración de la hormona en el material de prueba comparando los efectos de la muestra de prueba con los resultados de cantidades variables de proteína conocida ( ligando ).

Los fundamentos sobre los que se ha construido el ensayo de unión de ligandos son resultado del trabajo de Karl Landsteiner , en 1945, sobre la inmunización de animales mediante la producción de anticuerpos para ciertas proteínas. [ 9 ] El trabajo de Landsteiner demostró que la tecnología de inmunoensayo permitía a los investigadores analizar a nivel molecular. El primer ensayo de unión de ligandos exitoso fue reportado en 1960 por Rosalyn Sussman Yalow y Solomon Berson . [ 9 ] Investigaron la interacción de unión para la insulina y un anticuerpo específico de insulina, además de desarrollar el primer radioinmunoensayo (RIA) para la insulina. Estos descubrimientos proporcionaron información valiosa sobre la sensibilidad y especificidad de las hormonas proteicas presentes en los fluidos sanguíneos. [ 9 ] Yalow y Berson recibieron el Premio Nobel de Medicina como resultado de sus avances. Mediante el desarrollo de la tecnología RIA, los investigadores han podido ir más allá del uso de la radiactividad y, en su lugar, utilizar ensayos competitivos, inmunoradiométricos y en fase líquida y sólida. [ 9 ] Como resultado directo de estos hallazgos trascendentales, los investigadores han continuado el avance de los ensayos de unión de ligandos en muchas facetas en los campos de la biología, la química y afines. Por ejemplo, el laboratorio de Lois en Caltech está utilizando ligandos y receptores artificiales diseñados en neuronas para rastrear el flujo de información en el cerebro. [ 10 ] Específicamente, están utilizando la proteólisis intramembrana inducida por ligando para desentrañar el cableado del cerebro en Drosophila y otros modelos. [ 11 ] Cuando el ligando artificial en una neurona se une al receptor en otra, se activa la expresión de GFP en la neurona aceptora, lo que demuestra la utilidad de los ensayos de unión de ligandos en neurociencia y biología. [ 11 ]

Aplicaciones

Los ensayos de unión de ligandos proporcionan una medida de las interacciones que ocurren entre dos moléculas, como las uniones de proteínas, así como el grado de afinidad (conexión débil, fuerte o nula) con la que se unen los reactivos. [ 12 ] Los aspectos esenciales de los ensayos de unión incluyen, entre otros, el nivel de concentración de reactivos o productos ( véase la sección sobre sustancias radiactivas ), el mantenimiento de la constante de equilibrio de los reactivos durante todo el ensayo y la fiabilidad y validez de las reacciones vinculadas. [ 12 ] Aunque los ensayos de unión son sencillos, no proporcionan información sobre si el compuesto que se está probando afecta o no a la función del objetivo. [ 13 ]

Ensayos de radioligandos

Los radioligandos se utilizan para medir la unión del ligando a los receptores y, idealmente, deberían tener alta afinidad, baja unión no específica, alta actividad específica para detectar bajas densidades de receptores y especificidad de receptor. [ 7 ]

Los niveles de radiactividad de un radioligando (por mol) se denominan actividad específica (AE), que se mide en Ci/mmol. [ 14 ] La concentración real de un radioligando se determina mediante la mezcla madre específica de la que procede (del fabricante). [ 14 ] La siguiente ecuación determina la concentración real:

pagmetro=doPAGMETRO/SA(doPAGMETRO/Fmetrool)Voltúmetromi(metrol)×0,001(pagmetrool/Fmetrool)0,001(litmir/metrol)=(doPAGMETRO/SA)(Vol){\displaystyle pm={\frac {CPM/SA(CPM/fmol)}{Volumen(ml)}}\times {0.001(pmol/fmol) \over 0.001(litro/ml)}={(CPM/SA) \over (Vol)}}[ 14 ]

Unión de saturación

El análisis de saturación se utiliza en diversos tipos de tejidos, como fracciones de plasma parcialmente purificado de homogeneizados tisulares , células transfectadas con receptores clonados y células que se encuentran en cultivo o aisladas antes del análisis. [ 7 ] El análisis de unión por saturación permite determinar la afinidad y la densidad del receptor. Requiere que la concentración elegida se determine empíricamente para un nuevo ligando.

Existen dos estrategias comunes que se adoptan para este tipo de experimento: [ 7 ] Aumentar la cantidad de radioligando añadido manteniendo constantes tanto la actividad específica como la concentración del radioligando, o disminuir la actividad específica del radioligando debido a la adición de un ligando no marcado. [ 7 ]

Parcela de Scatchard

Un ejemplo de una parcela de Scatchard

Un gráfico de Scatchard (o gráfico de Rosenthal) puede utilizarse para mostrar la afinidad de un radioligando. En este tipo de gráfico, la relación entre el radioligando unido y el libre se representa frente al radioligando unido. La pendiente de la línea es igual al recíproco negativo de la constante de afinidad (K). La intersección de la línea con el eje X es una estimación de Bmax. [ 7 ] El gráfico de Scatchard puede estandarizarse con respecto a una referencia adecuada para poder comparar directamente la densidad de receptores en diferentes estudios y tejidos. [ 7 ] Este gráfico de ejemplo indica que el radioligando se une con una única afinidad. Si el ligando se hubiera unido a múltiples sitios con diferentes afinidades, el gráfico de Scatchard habría mostrado una línea cóncava . [ 7 ]

Ajuste de curvas no lineales

Los programas de ajuste de curvas no lineales, como Equilibrium Binding Data Analysis (EBDA) y LIGAND, se utilizan para calcular estimaciones de parámetros de unión a partir de experimentos de unión por saturación y competencia. [ 15 ] EBDA realiza el análisis inicial, que convierte la radiactividad medida en concentraciones molares y crea pendientes de Hill y transformaciones de Scatchard a partir de los datos. El análisis realizado por EBDA puede ser utilizado posteriormente por LIGAND para estimar un modelo específico para la unión. [ 15 ]

Competencia vinculante

La unión competitiva se utiliza para determinar la presencia de selectividad para un ligando particular en subtipos de receptores, lo que permite determinar la densidad y proporción de cada subtipo en el tejido. [ 7 ] Las curvas de competencia se obtienen graficando la unión específica, que es el porcentaje de la unión total, frente al logaritmo de la concentración del ligando competidor. [ 7 ] Una curva de competencia pronunciada suele indicar la unión a una sola población de receptores, mientras que una curva suave, o una curva con puntos de inflexión claros, indica múltiples poblaciones de sitios de unión. [ 15 ]

Ensayos de unión no radiactivos

A pesar de las diferentes técnicas utilizadas para los ensayos no radiactivos, estos requieren que los ligandos presenten características de unión similares a las de su equivalente radiactivo. Por lo tanto, los resultados en los ensayos no radiactivos y radiactivos se mantendrán consistentes. [ 5 ] Una de las mayores diferencias entre los ensayos de ligandos radiactivos y no radiactivos radica en los peligros para la salud humana. Los ensayos radiactivos son perjudiciales porque producen residuos radiactivos; mientras que los ensayos de ligandos no radiactivos utilizan un método diferente para evitar la producción de residuos tóxicos. Estos métodos incluyen, entre otros, la polarización de fluorescencia (FP), la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y la resonancia de plasmones superficiales (SPR). Para medir el proceso de unión ligando-receptor, la mayoría de los métodos no radiactivos requieren que el marcaje evite interferir con las interacciones moleculares. [ 5 ]

Polarización de fluorescencia

La polarización de fluorescencia (PF) es sinónimo de anisotropía de fluorescencia . Este método mide el cambio en la velocidad de rotación de un ligando marcado con fluorescencia una vez unido al receptor. [ 5 ] Se utiliza luz polarizada para excitar el ligando y se mide la cantidad de luz emitida. [ 5 ] La despolarización de la luz emitida depende de si el ligando está unido (por ejemplo, al receptor). Si el ligando no está unido, tendrá una gran despolarización (el ligando puede girar rápidamente, rotando la luz). Si el ligando está unido, el mayor tamaño combinado resulta en una rotación más lenta y, por lo tanto, una despolarización reducida. [ 5 ] Una ventaja de este método es que solo requiere un paso de marcaje. Sin embargo, este método es menos preciso a bajas concentraciones nanomolares . [ 5 ]

Ensayo de exclusión cinética

El ensayo de exclusión cinética (KinExA) mide el ligando libre (no unido) o el receptor libre presente en una mezcla de ligando, receptor y complejo ligando-receptor. Las mediciones permiten cuantificar la concentración del ligando activo y las constantes de unión (equilibrio, velocidades de asociación y disociación) de la interacción. [ 16 ]

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia

Diagrama de Jablonski de FRET

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) utiliza la energía transferida entre las moléculas donadora y aceptora que se encuentran muy próximas. [ 5 ] La FRET utiliza un ligando marcado con fluorescencia, como en el caso de la FP. [ 5 ] La transferencia de energía en la FRET comienza con la excitación del donador. [ 5 ] La interacción dipolo-dipolo entre el donador y la molécula aceptora transfiere la energía del donador a la molécula aceptora. [ 5 ] Si el ligando se une al complejo receptor-anticuerpo, el aceptor emitirá luz. [ 5 ] Al utilizar FRET, es fundamental que exista una distancia menor a 10  nm entre el aceptor y el donador, además de un espectro de absorción superpuesto entre el aceptor y el donador, y que el anticuerpo no interfiera ni bloquee el sitio de unión del ligando. [ 5 ]

Resonancia de plasmones superficiales

Configuración de resonancia de plasmones superficiales (SPR)

La resonancia de plasmones superficiales (SPR) no requiere el marcaje del ligando. [ 5 ] En cambio, funciona midiendo el cambio en el ángulo en el que la luz polarizada se refleja en una superficie ( índice de refracción ). [ 5 ] El ángulo está relacionado con el cambio en la masa o el espesor de la capa, como la inmovilización de un ligando que cambia el ángulo de resonancia, lo que aumenta la luz reflejada. [ 5 ] El dispositivo para el que se deriva la SPR incluye un chip sensor, una celda de flujo, una fuente de luz, un prisma y un detector de posición de ángulo fijo. [ 5 ]

Ensayos de unión en fase líquida

Inmunoprecipitación

El ensayo de unión de ligando en fase líquida de inmunoprecipitación (IP) es un método que se utiliza para purificar o enriquecer una proteína específica, o un grupo de proteínas, mediante un anticuerpo a partir de una mezcla compleja. El extracto de tejido o células lisadas se mezcla con un anticuerpo contra el antígeno de interés, lo que produce el complejo antígeno-anticuerpo. [ 17 ] Cuando la concentración de antígeno es baja, la precipitación del complejo antígeno-anticuerpo puede tardar horas o incluso días, y resulta difícil aislar la pequeña cantidad de precipitado formado. [ 17 ]

El ensayo inmunoenzimático ( ELISA ) o la transferencia Western son dos métodos diferentes para obtener y analizar el antígeno purificado (o múltiples antígenos). Este método consiste en purificar un antígeno mediante un anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido (en perlas), como la resina de agarosa. [ 18 ] El complejo proteico inmovilizado puede obtenerse en un solo paso o en varios. [ 18 ]

La IP también puede utilizarse junto con el marcaje radioisotópico biosintético. Mediante esta combinación de técnicas, se puede determinar si un antígeno específico es sintetizado por un tejido o por una célula. [ 17 ]

Ensayos de unión en fase sólida

placa de múltiples pocillos

Juego de placas multipocillo

Las placas de múltiples pocillos son varias placas de Petri integradas en un solo recipiente, con un número de pocillos individuales que varía de 6 a más de 1536. Los ensayos en placas de múltiples pocillos son convenientes para manejar las dosis y réplicas necesarias. [ 19 ] Existe una amplia gama de tipos de placas que tienen un tamaño estandarizado, equipo de soporte y sistemas de medición. [ 19 ] Se pueden integrar electrodos en la parte inferior de las placas para capturar información como resultado de los ensayos de unión. [ 9 ] Los reactivos de unión se inmovilizan en la superficie del electrodo y luego se pueden analizar. [ 9 ]

Las placas de múltiples pocillos se fabrican para permitir a los investigadores crear y manipular diferentes tipos de ensayos (es decir, bioensayos , inmunoensayos , etc.) dentro de cada placa. [ 19 ] Debido a la variabilidad en el formato de las placas de múltiples pocillos, no es raro que aparezcan artefactos. Estos artefactos se deben a los diferentes entornos que se encuentran dentro de los distintos pocillos de la placa, especialmente cerca de los bordes y el centro de los mismos. Dichos efectos se conocen como efectos de pocillo, efectos de borde y efectos de placa. Por lo tanto, se enfatiza la necesidad de posicionar los diseños de ensayo de la manera correcta tanto dentro como entre cada placa. [ 19 ]

El uso de placas de múltiples pocillos es común al medir la actividad de ensayos biológicos in vitro o al medir la inmunorreactividad mediante inmunoensayos. [ 19 ] Los artefactos pueden evitarse manteniendo la uniformidad de la placa mediante la aplicación de la misma dosis del medio específico en cada pocillo, además de mantener la presión atmosférica y la temperatura para reducir la humedad. [ 19 ]

Encuadernación en cuentas

Los ensayos de unión de ligandos en microesferas son métodos de aislamiento para proteínas básicas, ADN/ARN u otras biomoléculas presentes en suspensiones no definidas y pueden utilizarse en diversas aplicaciones biocromatográficas. Los ligandos bioafines se unen covalentemente a microesferas de sílice con grupos silanol terminales cargados negativamente o a microesferas de poliestireno, y se utilizan para el aislamiento y la purificación de proteínas básicas o la adsorción de biomoléculas. Tras la unión, la separación se realiza mediante centrifugación (separación por densidad) o atracción por campo magnético (solo para partículas magnéticas). Las microesferas pueden lavarse para garantizar la pureza de la molécula aislada antes de disolverla mediante métodos de intercambio iónico. Los métodos de análisis directo basados ​​en la detección enzimática/fluorescente (p. ej., HRP, colorante fluorescente) pueden utilizarse para la determinación o cuantificación de biomoléculas unidas en microesferas. [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]

Encuadernación en columna

Filtrar

Los ensayos de filtración son ensayos de unión de ligandos en fase sólida que utilizan filtros para medir la afinidad entre dos moléculas. En un ensayo de unión de filtración , los filtros se utilizan para atrapar las membranas celulares aspirando el medio a través de ellos. [ 8 ] Este método rápido se realiza a una velocidad elevada en la que se puede lograr la filtración y la recuperación de la fracción encontrada. [ 23 ] El lavado de los filtros con un tampón elimina los ligandos residuales no unidos y cualquier otro ligando presente que pueda ser eliminado de los sitios de unión. [ 8 ] Los complejos receptor-ligando presentes durante el lavado del filtro no se disociarán significativamente porque quedarán completamente atrapados por los filtros. [ 8 ] Las características del filtro son importantes para cada tarea que se realiza. Un filtro más grueso es útil para obtener una recuperación más completa de pequeños fragmentos de membrana, pero puede requerir un tiempo de lavado más prolongado. [ 8 ] Se recomienda pretratar los filtros para ayudar a atrapar los fragmentos de membrana con carga negativa. [ 8 ] Sumergir el filtro en una solución que le diera una carga superficial positiva atraería los fragmentos de membrana cargados negativamente. [ 8 ]

Unión celular en tiempo real

En este tipo de ensayo, se realiza un seguimiento de la unión de un ligando a las células a lo largo del tiempo. La señal obtenida es proporcional al número de ligandos unidos a una estructura diana, a menudo un receptor, en la superficie celular. La información sobre la interacción ligando-diana se obtiene a partir del cambio de señal a lo largo del tiempo y se pueden calcular parámetros cinéticos como la constante de velocidad de asociación k a , la constante de velocidad de disociación k d y la afinidad K D. [ 24 ] Al medir la interacción directamente en las células, no es necesario aislar la proteína diana, lo que de otro modo puede ser difícil, especialmente para algunas proteínas de membrana. [ 25 ] Para asegurar que se mida la interacción con la estructura diana prevista, se recomiendan controles biológicos apropiados, como células que no expresen la estructura diana.

Se han utilizado mediciones en tiempo real mediante métodos sin marcadores o con marcadores para analizar interacciones biomoleculares en células fijadas o vivas. [ 26 ] [ 27 ]

La ventaja de medir las interacciones ligando-receptor en tiempo real es que no es necesario alcanzar el equilibrio de unión para determinar con precisión la afinidad. [ 28 ]

Especificidad de unión

Los efectos de un fármaco son resultado de su selectividad de unión con las propiedades macromoleculares de un organismo, o de la afinidad con la que diferentes ligandos se unen a un sustrato. [ 29 ] Más específicamente, la especificidad y selectividad de un ligando a su receptor respectivo brinda a los investigadores la oportunidad de aislar y producir efectos farmacológicos específicos mediante la manipulación de las concentraciones de ligando y las densidades de receptores. [ 29 ] Las hormonas y los neurotransmisores son ligandos reguladores endógenos esenciales que afectan a los receptores fisiológicos dentro de un organismo. [ 29 ] Los fármacos que actúan sobre estos receptores son increíblemente selectivos para producir las respuestas requeridas de las moléculas de señalización. [ 29 ]

La unión específica se refiere a la unión de un ligando a un receptor, y es posible que exista más de un sitio de unión específico para un ligando. [ 30 ] La unión no específica se refiere a la unión de un ligando a algo distinto de su receptor designado, como otros receptores o diferentes tipos de transportadores en la membrana celular. [ 30 ] Por ejemplo, varios antagonistas pueden unirse a múltiples tipos de receptores. En el caso de los antagonistas muscarínicos, también pueden unirse a los receptores de histamina. [ 30 ] Estos patrones de unión se consideran técnicamente específicos, ya que el destino del ligando es específico para múltiples receptores. Sin embargo, es posible que los investigadores no se centren en estos comportamientos en comparación con otros factores de unión. [ 30 ] No obstante, el comportamiento de unión no específica es información muy importante que se debe obtener. Estas estimaciones se miden examinando cómo un ligando se une a un receptor mientras reacciona simultáneamente a un agente sustituto (antagonista) que impedirá que se produzca la unión específica. [ 30 ]

Tipos de unión específicos a las interacciones ligando-receptor: [ 29 ]

avances tecnológicos

Las tecnologías para el ensayo de unión de ligandos siguen avanzando en relación con el aumento de la velocidad y el mantenimiento de procedimientos rentables, al tiempo que se mantiene y aumenta la precisión y la sensibilidad. [ 9 ] Algunos avances tecnológicos incluyen nuevos reactivos de unión como alternativas a los anticuerpos, [ 9 ] soluciones de colorantes alternativas y sistemas de microplacas, y el desarrollo de métodos para omitir el paso de filtración, que es necesario en muchos procesos de ensayo de unión de ligandos. [ 7 ] [ 31 ]

Una molécula de señalización prominente en las células es el calcio (Ca2+), que puede detectarse con el colorante acetoximetilo Fluo-4 . Este se une a los iones Ca2+ libres, lo que a su vez aumenta ligeramente la fluorescencia del Fluo-4 AM. [ 7 ] La ​​desventaja de la formulación del colorante Fluo-4 es que se requiere un paso de lavado para eliminar el colorante extracelular, lo que puede generar señales de fondo no deseadas. Por ejemplo, el lavado ejerce un estrés adicional sobre las células, además de consumir tiempo, lo que impide un análisis oportuno. [16] Recientemente, se ha desarrollado una solución de colorante alternativa y un sistema de microplacas llamado FLIPR® (lector de placas de imágenes fluorimétricas), que utiliza un reactivo de ensayo de calcio 3 que no requiere un paso de lavado. Como resultado, el cambio en la fluorescencia del colorante puede observarse en tiempo real sin demora utilizando un láser excitador y un dispositivo de carga acoplada . [ 7 ]

Muchos ensayos de unión de ligandos requieren un paso de filtración para separar los ligandos unidos de los no unidos antes del cribado. Recientemente se ha desarrollado un método llamado ensayo de proximidad por centelleo (SPA, por sus siglas en inglés), que elimina este paso, que de otro modo sería crucial. Funciona mediante microesferas de red cristalina, recubiertas con moléculas de acoplamiento de ligandos y rellenas con iones de cerio . Estas emiten destellos de luz al ser estimuladas por un isótopo, que se puede medir fácilmente. Los ligandos se radiomarcan con 3H o 125I y se liberan en el ensayo. Dado que solo los radioligandos que se unen directamente a las microesferas inician una señal, los ligandos libres no interfieren durante el proceso de cribado. [ 7 ]

La estructura conformacional y los movimientos vibracionales pueden cambiar entre el estado libre de ligando y el estado unido a ligando de una proteína. El ensayo de respuesta de dinámica estructural (SDR) detecta cambios mediados por ligando en el movimiento natural de una proteína diana. Estos cambios pueden acoplarse a la intensidad de la luz emitida por una proteína sensora de luciferasa fusionada a la proteína diana para proporcionar una medida altamente sensible de la unión del ligando. Además, el ensayo SDR no requiere ligandos marcados, pasos de separación ni gradientes térmicos, y se ha demostrado que funciona con volúmenes de ensayo tan bajos como 6 µL. [ 31 ]

Limitaciones

Tomografía por emisión de positrones (PET) de cuerpo entero con 18F -FDG.

Por su naturaleza, los ensayos deben realizarse en un entorno controlado in vitro, por lo que este método no proporciona información sobre la unión a receptores in vivo. Los resultados obtenidos solo permiten verificar que un ligando específico se une a un receptor, pero los ensayos no ofrecen ninguna forma de conocer la distribución de los receptores de unión a ligandos en un organismo.

La unión de ligandos y la distribución de receptores in vivo pueden estudiarse mediante tomografía por emisión de positrones (PET), que funciona mediante la inducción de un radionúclido en un ligando, el cual se libera posteriormente en el organismo estudiado. Los ligandos radiomarcados se localizan espacialmente mediante un escáner PET para revelar áreas del organismo con altas concentraciones de receptores. [ 15 ]

Véase también

Referencias

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