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El nitrógeno asimilable por levaduras ( YAN) es la combinación de nitrógeno amino libre (FAN), amoníaco (NH₃ ) y amonio (NH₄⁺ ) disponible para que una levadura, por ejemplo, la levadura del vino Saccharomyces cerevisiae , lo utilice durante la fermentación . Además de los azúcares fermentables glucosa y fructosa , el nitrógeno es el nutriente más importante para llevar a cabo una fermentación exitosa que no termine antes del punto de secado deseado ni presente olores extraños y defectos relacionados en el vino . Por ello, los enólogos suelen complementar los recursos de YAN disponibles con aditivos nitrogenados como el fosfato diamónico (DAP). [ 1 ]
Sin embargo, la adición de cantidades excesivas de nitrógeno también puede crear un peligro, ya que otros organismos además de las levaduras beneficiosas del vino pueden utilizar los nutrientes. Estos incluyen organismos de deterioro como Brettanomyces , Acetobacter y bacterias lácticas de los géneros Lactobacillus y Pediococcus . Por esta razón, muchas bodegas miden el nitrógeno asimilable por levaduras (YAN) después de la vendimia y el estrujado utilizando uno de los diversos métodos disponibles actualmente, incluido el análisis de nitrógeno por o-ftalaldehído (NOPA), que requiere el uso de un espectrómetro , o el método de titulación con formol . Conocer el YAN en el mosto permite a los enólogos calcular la cantidad correcta de aditivo necesaria para completar la fermentación, dejando solo un "desierto de nutrientes" para cualquier organismo de deterioro que aparezca posteriormente. [ 2 ]
La cantidad de YAN que los enólogos verán en sus mostos de uva depende de varios componentes, incluyendo la variedad de uva , el portainjerto , los suelos del viñedo y las prácticas vitivinícolas (como el uso de fertilizantes y el manejo del follaje ), así como las condiciones climáticas de añadas particulares . [ 3 ]
Componentes
YAN es una medida de las fuentes primarias orgánicas (aminoácidos libres) e inorgánicas (amoniaco y amonio) de nitrógeno que pueden ser asimiladas por S. cerevisiae . Existen varios compuestos nitrogenados que se encuentran en el mosto y el vino, incluidos péptidos , proteínas más grandes , amidas , aminas biogénicas , piridinas , purinas y ácidos nucleicos , pero estos no pueden ser utilizados directamente por la levadura para el metabolismo. En conjunto, el contenido total de nitrógeno del mosto de uva puede variar de 60 a 2400 mg de nitrógeno por litro; sin embargo, no todo este nitrógeno será asimilable. [ 1 ] La falta de enzimas proteasas , que descomponen los péptidos más grandes en componentes más pequeños, que pueden actuar fuera de la célula, limita el tamaño de las moléculas que la levadura puede utilizar como fuente de nitrógeno. [ 3 ] [ 4 ]
La cantidad de YAN que los enólogos encontrarán en sus mostos depende de varios componentes, incluyendo la variedad de uva, el portainjerto, los suelos del viñedo y las prácticas vitivinícolas (como el uso de fertilizantes y el manejo del follaje), así como las condiciones climáticas de cada añada. Las infecciones por moho, como Botrytis cinerea (conocida como podredumbre noble cuando se busca), pueden reducir el contenido de aminoácidos del mosto hasta en un 61%. [ 1 ] Algunas regiones se caracterizan por tener bajos niveles de YAN, como el estado de Washington , donde durante una añada típica el 90% del mosto analizado estará por debajo de 400 mg N/L [ 5 ] y casi una cuarta parte estará por debajo de 150 mg N/L. [ 2 ]
En el viñedo, la vid absorbe el nitrógeno en forma de nitrato (NO₃⁻ ) , amonio o urea , que se reduce a amoníaco. Mediante reacciones adicionales, el nitrógeno se incorpora a la glutamina y el glutamato , y finalmente se utiliza en la síntesis de otros aminoácidos y compuestos nitrogenados. [ 1 ] Tras la vendimia, la mayor parte (alrededor del 80 %) de los compuestos nitrogenados disponibles en las uvas se concentran en la piel y las semillas. Estos compuestos se liberan al mosto durante el proceso de estrujado y durante la maceración /contacto con la piel. [ 4 ] Incluso después del prensado , hasta el 80 % del contenido inicial de nitrógeno de cada baya de uva permanece en el orujo . [ 3 ]
Aminoácidos
Del nitrógeno amino libre (FAN) que compone el YAN, los aminoácidos arginina , prolina y glutamina son los más abundantes, seguidos de alanina , treonina , serina y ácido aspártico en concentraciones mucho menores [ 1 ] aunque se pueden encontrar cantidades traza de la mayoría de los aminoácidos conocidos en el mosto de uva. [ 2 ] La prolina suele ser la más concentrada y puede representar hasta el 30% de la cantidad total de aminoácidos. [ 4 ] La cantidad exacta de FAN variará y puede oscilar entre 22 y 1242 mg de nitrógeno/litro de YAN derivado de aminoácidos libres. [ 5 ]
Si bien la arginina, la glutamina y otros aminoácidos se consumen rápidamente, a menudo muy pronto en la fermentación, la prolina no es consumida por la levadura en absoluto durante las condiciones normales y anaeróbicas de la fermentación. Esto se debe a que una de las enzimas necesarias para su utilización es una oxidasa (que requiere oxígeno molecular) y la otra es reprimida por la presencia de amonio (otra fuente de nitrógeno asimilable que necesita la levadura) en el mosto. Sin embargo, los cultivos iniciadores bien aireados que contienen mosto al que no se le ha añadido fosfato diamónico generalmente observarán cierta utilización de prolina antes de que comiencen las condiciones anaeróbicas de la fermentación. [ 1 ] Cuando los enólogos miden el FAN, deben tener en cuenta si su ensayo incluye prolina, ya que esto hará que su medición de YAN sea mayor. Chardonnay y Cabernet Sauvignon son dos variedades de Vitis vinifera que se caracterizan por tener niveles muy altos de prolina, mientras que Riesling y Sauvignon blanc suelen tener niveles muy bajos. [ 4 ]
La levadura transporta aminoácidos y péptidos pequeños (de menos de 5 residuos de aminoácidos ) al interior de la célula mediante un proceso de transporte activo que utiliza proteínas de membrana especializadas y la diferencia en el gradiente de pH entre la solución ácida del vino (pH entre 3 y 4) y el pH casi neutro del citoplasma dentro de las células de levadura. Las proteínas de simporte de protones en la membrana captan el aminoácido acoplado a un ion hidrógeno que posteriormente es expulsado por la célula mediante una bomba de iones hidrógeno . Este es un proceso dependiente de energía que se vuelve energéticamente más desfavorable para la célula de levadura a medida que avanza la fermentación y aumentan los niveles de etanol, creando una "fuga pasiva" de iones hidrógeno en exceso hacia el interior de la célula. Las bombas de iones hidrógeno de la célula tienen que trabajar aún más para mantener su pH interno, por lo que envían una señal a las proteínas de simporte para que dejen de transportar otros iones. Esta es una de las razones por las que las adiciones de nitrógeno al final de la fermentación tienen poca o ninguna efectividad, ya que los mecanismos de transporte de nitrógeno al interior de la célula se desactivan. [ 4 ]
compuestos de amoníaco
Durante la fermentación, el amonio es la principal forma de nitrógeno asimilable disponible para la levadura. [ 1 ] Sin embargo, al prensar el mosto, este puede contener entre 0 y 150 mg/L de sales de amonio, dependiendo de la cantidad de nitrógeno que la vid recibió en el viñedo. [ 4 ]
En la célula, el amoníaco inorgánico y los iones amonio se "fijan" mediante una serie de reacciones químicas que, en última instancia, producen glutamato, una fuente de nitrógeno orgánico. [ 2 ] El ion amonio también actúa como regulador alostérico de una de las enzimas utilizadas en la glucólisis y puede influir en cómo la célula de levadura transporta glucosa y fructosa al interior de la célula. [ 4 ] Se ha demostrado que las proteínas utilizadas en el sistema principal de transporte de glucosa tienen una vida media de 12 horas. En los estudios que sometieron a las células de levadura a "privación de amoníaco", todo el sistema se detuvo después de 50 horas, lo que proporciona una fuerte evidencia de que la falta de amoníaco/amonio puede aumentar el riesgo de que la fermentación se detenga. [ 3 ]
El glutatión (GSH: L-gamma-glutamil-L-cisteinilglicina) está presente en altas concentraciones, hasta 10 mM, en las células de levadura. Desempeña un papel fundamental en respuesta a la deficiencia de azufre y nitrógeno. [ 6 ]
El amoníaco no es utilizado por bacterias como Acetobacter y las bacterias del ácido láctico utilizadas en la fermentación maloláctica . [ 2 ]
Importancia en la elaboración del vino
El nitrógeno asimilable es un nutriente esencial que la levadura del vino necesita para completar la fermentación con una cantidad mínima de subproductos indeseables (como compuestos como el sulfuro de hidrógeno, que pueden generar olores desagradables). Durante la fermentación, la levadura puede utilizar hasta 1000 mg/L de aminoácidos, aunque a menudo la cantidad es mucho menor de la necesaria. [ 2 ] La levadura puede almacenar aminoácidos en vacuolas intracelulares y luego utilizarlos directamente, incorporándolos a las proteínas, o descomponerlos y utilizar sus componentes de carbono y nitrógeno por separado. [ 4 ]
En ausencia de nitrógeno, la levadura comenzará a detenerse y morir. Algunas cepas comenzarán a descomponer aminoácidos que contienen azufre, como la cisteína y la metionina , liberando un átomo de azufre que puede combinarse con hidrógeno para producir sulfuro de hidrógeno ( H).2 S) que puede impartir olores a huevo podrido al vino. Sin embargo, no existe una correlación directa entre los niveles de YAN y la producción de sulfuro de hidrógeno, ya que la levadura puede producir H2S incluso en presencia de nitrógeno abundante, pero con la deficiencia de otros nutrientes vitales (como la vitaminaácido pantoténico). Incluso existen algunas cepas deS. cerevisiaeque producen H2S como respuesta a un exceso de nitrógeno disponible (en particular, un exceso de ácido glutámico y alanina [ 3 ] ). Por ello, un enfoque profiláctico de añadir suplementación de nitrógeno indiscriminadamente a cada fermentación puede no tener los resultados deseados para prevenir la formación de H2S. [ 2 ]
Los niveles de nitrógeno en el vino pueden influir en muchos aspectos sensoriales del mismo, incluyendo la síntesis de numerosos compuestos aromáticos. Los alcoholes fusel se producen por la degradación de aminoácidos, aunque en presencia de altos niveles de amoníaco y urea su producción se reduce. Cuando el nitrógeno disponible es limitado, los niveles de glicerol y trehalosa , que pueden influir en la sensación en boca , son más elevados. [ 3 ]
Estimaciones sobre la cantidad necesaria
La cantidad de nitrógeno amoniacal necesario dependerá de los objetivos del enólogo para la fermentación, en particular de si se desea una fermentación espontánea o si el vino se fermentará completamente hasta la sequedad. El estado de las uvas y las condiciones de fermentación influirán en la cantidad de nitrógeno necesaria. La fruta dañada, mohosa o infectada con botritis generalmente tendrá un menor contenido de nitrógeno (así como de otras vitaminas) al llegar del viñedo que las uvas limpias e intactas. Este agotamiento puede agravarse aún más por una clarificación excesiva del mosto y un alto contenido de azúcar. Los vinos fermentados a temperaturas más altas tienden a progresar más rápidamente, requiriendo más nitrógeno que las fermentaciones más largas y frías. Asimismo, la cantidad de exposición al oxígeno influirá en la tasa de absorción de nitrógeno por la levadura; los vinos fermentados en condiciones completamente anaeróbicas (como muchos vinos blancos en tanques de acero inoxidable) requieren menos nitrógeno que los vinos fermentados en barricas o depósitos abiertos. [ 7 ]
El rango sugerido por los enólogos varía de 150 mg/L de YAN [ 8 ] a 400 mg de nitrógeno por litro. [ 9 ] Algunos estudios han demostrado que se pueden alcanzar tasas máximas de fermentación con YAN en el rango de 400 a 500 mg N/L. [ 10 ] Sin embargo, no todos los enólogos querrán que la fermentación se desarrolle a la máxima velocidad (en términos de biomasa de levadura, temperatura y velocidad) debido al impacto que puede tener en otros aspectos sensoriales del vino, como el desarrollo del aroma y la retención de fruta. [ 3 ]
Un estudio del Departamento de Viticultura y Enología de la UC Davis encontró que las recomendaciones sobre los niveles óptimos de nitrógeno para completar una fermentación exitosa podrían basarse en el nivel Brix de la cosecha , que ha sido adoptado por muchos fabricantes de levaduras y nutrientes. [ 11 ] [ 12 ]
- 21°Bx = 200 mg N/L
- 23°Bx = 250 mg N/L
- 25°Bx = 300 mg N/L
- 27°Bx = 350 mg N/L
Sin embargo, otros estudios han demostrado que se puede llevar a cabo una fermentación exitosa con niveles de YAN por debajo de estas recomendaciones, así como fermentaciones lentas o estancadas incluso cuando los niveles de YAN están en línea con las recomendaciones. [ 1 ]
En la fermentación maloláctica
Al igual que la levadura, las bacterias lácticas (BAL) utilizadas en la fermentación maloláctica (generalmente Oenococcus oeni ) requieren nitrógeno. Sin embargo, a diferencia de S. cerevisiae, las BAL no pueden utilizar amoníaco, y aditivos como el fosfato diamónico (DAP) no ofrecen beneficios nutricionales. Los enólogos que utilizan DAP inadvertidamente como aditivo nutritivo para la inoculación de la fermentación maloláctica corren el riesgo de proporcionar nutrientes a organismos que causan deterioro, como Brettanomyces . [ 2 ]
Si bien algunos enólogos inoculan sus bacterias lácticas con nutrientes que incluyen nitrógeno, la mayoría de los nutrientes necesarios para la fermentación maloláctica provienen de la descomposición (o autólisis ) de las células de levadura muertas. Además, la mayoría de las bacterias utilizadas en la fermentación maloláctica tienen la capacidad de producir enzimas proteasas extracelulares que también pueden descomponer cadenas peptídicas más largas en sus residuos de aminoácidos básicos, los cuales pueden utilizarse para el metabolismo. [ 4 ]
Mediciones y pruebas
El ensayo de nitrógeno por o-ftalaldehído (NOPA) se utiliza para medir los aminoácidos primarios disponibles en el jugo de uva mediante un espectrofotómetro que puede medir a una longitud de onda de 335 nm . Dado que el ensayo solo mide aminoácidos primarios, los resultados no incluirán las concentraciones de prolina o amoníaco. [ 13 ] La prolina se puede medir por separado con un ensayo que utiliza ninhidrina para reaccionar con el aminoácido en presencia de ácido fórmico , produciendo un compuesto que puede ser absorbido a 517 nm. [ 1 ]
La titulación con formol , inventada por el químico danés SPL Sørensen en 1907, utiliza formaldehído en presencia de hidróxido de potasio o sodio para medir la concentración de aminoácidos y amoníaco con la ayuda de un medidor de pH . Los reactivos también reaccionan con la prolina, lo que puede dar una medición de YAN ligeramente superior a la de NOPA. [ 14 ] El método de titulación con formol también tiene las desventajas de implicar el uso y la eliminación de formaldehído, que es un carcinógeno conocido [ 15 ] y el reactivo altamente tóxico cloruro de bario . [ 1 ]
El amoníaco y el amonio se pueden medir utilizando un electrodo selectivo de iones y un medidor de pH. [ 1 ]
Suplementación de nitrógeno
Los enólogos saben desde hace mucho tiempo que algunas fermentaciones resultan más predecibles y "saludables" si se añade orujo (los hollejos, semillas y restos sólidos que quedan tras el prensado ) de otro vino a la mezcla. Este método se sigue utilizando hoy en día para elaborar el vino italiano Ripasso . En la Toscana del siglo XIV , la técnica del gobernador, empleada en algunos de los primeros Chianti, consistía en añadir uvas pasas a la mezcla. [ 16 ] Si bien esto también añadía azúcar, ambos métodos proporcionaban nitrógeno adicional y otros nutrientes aún disponibles en los hollejos y las semillas. [ 17 ]
A medida que los enólogos fueron comprendiendo mejor la ciencia de la fermentación, el nitrógeno se identificó como un nutriente principal y los viticultores ya en la década de 1900 comenzaron a agregar sales de amonio a su mosto. [ 4 ] La urea también se usó como un suplemento de nitrógeno inicial, pero las investigaciones que la vinculan con el desarrollo del carbamato de etilo han llevado a su prohibición en muchos países, incluidos los Estados Unidos desde 1990. [ 2 ] [ 18 ] [ 19 ]
Existen muchos tipos de suplementos nitrogenados disponibles para los enólogos. La mayoría son formulaciones complejas que incluyen nitrógeno (proveniente de aminoácidos o sales de amonio) junto con vitaminas, minerales y otros factores de crecimiento, y se comercializan bajo marcas como Go-Ferm , Superfood y Fermaid K (estas dos últimas también contienen DAP). [ 2 ] Los aminoácidos pueden añadirse directamente al mosto, aunque desde 2010 solo se permite añadir glicina al mosto en Estados Unidos. [ 4 ]
Las envolturas de levadura (o fantasmas de levadura) son los restos de las paredes celulares de la levadura que quedan de la producción comercial de cepas de levadura utilizadas para la inoculación. Además de proporcionar una fuente de nitrógeno asimilable a partir de aminoácidos, también proporcionan lípidos y esteroles que las células pueden utilizar para fortalecer su membrana plasmática, lo que permite la absorción de otras fuentes de nitrógeno. [ 2 ]
Riesgo de añadir demasiado
Los suplementos de nitrógeno, en particular el DAP, estimulan la reproducción de la levadura y pueden aumentar considerablemente la biomasa. Esto podría acelerar la fermentación más de lo deseado por el enólogo y también incrementar la temperatura de fermentación debido al calor generado por la levadura. El exceso de biomasa también puede provocar una escasez de otros nutrientes para la levadura, como vitaminas y esteroles, debido a la mayor competencia, y puede dar lugar a la producción de olores desagradables (como sulfuro de hidrógeno) e incluso a fermentaciones detenidas. [ 1 ]
Los niveles excesivos del aminoácido arginina (superiores a 400 mg/L), especialmente cerca del final de la fermentación, pueden aumentar el riesgo de producción de carbamato de etilo. Esto se debe a que la arginina se descompone en urea, la cual puede ser reabsorbida y utilizada por la levadura o metabolizada en amoníaco. Sin embargo, la urea también reacciona con el etanol si no se metaboliza completamente, lo que, junto con una exposición prolongada (así como altas temperaturas), puede conducir a la producción del éster carbamato de etilo. [ 1 ]
Sin embargo, el mayor riesgo de añadir demasiados nutrientes al mosto es que queden restos de nitrógeno y otros nutrientes una vez finalizada la fermentación. Esto puede generar inestabilidad microbiana, ya que los microorganismos responsables del deterioro pueden aprovechar estos nutrientes sobrantes. [ 3 ]
Leyes y reglamentos sobre el vino
En Estados Unidos, la Oficina de Impuestos y Comercio de Alcohol y Tabaco (TTB) limita el uso de fosfato diamónico como aditivo nitrogenado a 968 mg/L (8 lb/1000 gal), lo que proporciona 203 mg N/L de nitrógeno acuoso juvenil (NAJ). En la Unión Europea , la mayoría de los países siguen las directrices de la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV), que establece un límite de 300 mg/L. En Australia , el límite se basa en el nivel de fosfato inorgánico , con un límite máximo permitido de 400 mg/L de fosfato. [ 2 ]
Influencia del momento
Como la mayoría de los suplementos nutricionales alimentan a todos los microorganismos vivos del mosto (sean deseables o no), los enólogos suelen esperar a añadir los nutrientes hasta que estén listos para inocular el mosto con la cepa de S. cerevisiae deseada . Los productores que utilizan fermentaciones espontáneas también pueden esperar hasta que la adición de dióxido de azufre haya eliminado los microbios no deseados o añadir los nutrientes antes, ya que desean la complejidad potencial que otros microbios podrían aportar al vino. Cuando se añade, el nitrógeno suele estar en forma de aminoácidos, combinado con vitaminas y minerales para ayudar a iniciar la fermentación. [ 2 ]
Poco después de la inoculación, la levadura comienza a consumir rápidamente el nitrógeno asimilable disponible, llegando a consumirse hasta el 46 % del nitrógeno asimilable disponible al inicio de la fermentación completa. [ 1 ] Debido a que el nitrógeno inorgánico, como las sales de amonio en el DAP, es tóxico para la levadura en altas concentraciones, nunca se añade durante la inoculación cuando la biomasa de la levadura recién rehidratada es baja. Muchos enólogos dividen la dosificación de DAP, realizando la primera adición al final de la fase de latencia , cuando la levadura entra en su período de crecimiento exponencial y comienza la fermentación alcohólica. En la mayoría de los mostos, esto ocurre entre 48 y 72 horas después de la inoculación. A menudo se añade una segunda dosis aproximadamente a un tercio del proceso de fermentación del azúcar, y generalmente antes de que los niveles de azúcar alcancen los 12-10 Brix (6,5 a 5,5 Baumé, 48,3 a 40,0 Oechsle), ya que, a medida que avanza la fermentación, las células de levadura dejan de absorber el nitrógeno debido a la creciente toxicidad del etanol que las rodea. Esto deja el nitrógeno sin utilizar y disponible para los microorganismos responsables del deterioro que puedan aparecer posteriormente. [ 2 ] [ 3 ]
Referencias
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