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fenilalanina hidroxilasa

La fenilalanina hidroxilasa ( PAH ) ( EC 1.14.16.1 ) es una enzima que cataliza la hidroxilación de la cadena lateral aromática de la fenilalanina para generar tirosina . La PAH...

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La fenilalanina hidroxilasa ( PAH ) ( EC 1.14.16.1 ) es una enzima que cataliza la hidroxilación de la cadena lateral aromática de la fenilalanina para generar tirosina . La PAH es uno de los tres miembros de las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos dependientes de biopterina , una clase de monooxigenasa que utiliza tetrahidrobiopterina (BH4 , un cofactor de pteridina ) y un hierro no hemo para la catálisis. Durante la reacción, el oxígeno molecular se escinde heterolíticamente con la incorporación secuencial de un átomo de oxígeno en el sustrato BH4 y fenilalanina. [ 5 ] [ 6 ] En humanos, las mutaciones en su gen codificante, PAH , pueden conducir al trastorno metabólico fenilcetonuria .

Mecanismo enzimático

Se cree que la reacción se desarrolla a través de los siguientes pasos:

  1. formación de un puente Fe(II)-OO-BH 4 .
  2. escisión heterolítica del enlace OO para producir el intermedio hidroxilante ferrilo oxo Fe(IV)=O
  3. ataque sobre Fe(IV)=O para hidroxilar el sustrato fenilalanina a tirosina. [ 7 ]
Formación y escisión de un puente Fe(II)-OO-BH4.
Mecanismo de los HAP, parte I

Formación y escisión del puente hierro-peroxipterina. Aunque la evidencia apoya firmemente a Fe(IV)=O como el intermedio hidroxilante, [ 8 ] los detalles mecanísticos subyacentes a la formación del puente Fe(II)-OO-BH 4 antes de la escisión heterolítica siguen siendo controvertidos. Se han propuesto dos vías basadas en modelos que difieren en la proximidad del hierro al cofactor pterina y el número de moléculas de agua que se supone que están coordinadas al hierro durante la catálisis. Según un modelo, un complejo de hierro-dioxígeno se forma inicialmente y se estabiliza como un híbrido de resonancia de Fe 2+ O 2 y Fe 3+ O 2 − . El O 2 activado ataca entonces a BH 4 , formando un estado de transición caracterizado por la separación de carga entre el anillo de pterina deficiente en electrones y la especie de dioxígeno rica en electrones. [ 9 ] Posteriormente se forma el puente Fe(II)-OO-BH 4 . Por otro lado, la formación de este puente se ha modelado asumiendo que BH4 se encuentra en la primera capa de coordinación del hierro y que el hierro no está coordinado a ninguna molécula de agua. Este modelo predice un mecanismo diferente que involucra un radical pterina y superóxido como intermediarios críticos. [ 10 ] Una vez formado, el puente Fe(II)-OO-BH 4 se rompe a través de la escisión heterolítica del enlace OO a Fe(IV)=O y 4a-hidroxitetrahidrobiopterina; por lo tanto, el oxígeno molecular es la fuente de ambos átomos de oxígeno utilizados para hidroxilar el anillo de pterina y la fenilalanina.

Hidroxilación de fenilalanina a tirosina.
Mecanismo de los HAP, parte II

Hidroxilación de fenilalanina por intermedio ferril oxo. Debido a que el mecanismo involucra un intermedio hidroxilante Fe(IV)=O (en lugar de una peroxipterina), la oxidación del cofactor BH 4 y la hidroxilación de fenilalanina pueden desacoplarse, lo que resulta en un consumo improductivo de BH 4 y la formación de H 2 O 2 . [ 7 ] Sin embargo, cuando es productiva, el intermedio Fe(IV)=O se agrega a la fenilalanina en una reacción de sustitución aromática electrofílica que reduce el hierro del estado ferril al estado ferroso. [ 7 ] Aunque inicialmente se propuso un intermedio de óxido de areno o radical, los análisis de las hidroxilasas de triptófano y tirosina relacionadas han sugerido que la reacción procede en cambio a través de un intermedio catiónico que requiere que Fe(IV)=O esté coordinado a un ligando de agua en lugar de un grupo hidroxilo. [ 7 ] [ 11 ] Este intermedio catiónico posteriormente sufre un desplazamiento NIH de 1,2-hidruro, produciendo un intermedio dienona que luego tautomeriza para formar el producto tirosina. [ 12 ] El cofactor pterina se regenera por hidratación del producto carbinolamina de PAH a dihidrobiopterina quinonoide (qBH 2 ), que luego se reduce a BH 4 . [ 13 ]

Regulación enzimática

Se propone que PAH utilice el modelo de morfeína de regulación alostérica . [ 14 ] [ 15 ]

Los HAP de mamíferos existen en un equilibrio que consiste en tetrámeros de dos arquitecturas distintas, con una o más formas diméricas como parte del equilibrio. Este comportamiento es consistente con un mecanismo alostérico disociativo. [ 15 ]

Muchos estudios sugieren que el PAH de mamíferos muestra un comportamiento comparable al de la porfobilinógeno sintasa (PBGS), en la que se ha informado que una variedad de factores como el pH y la unión de ligandos afectan la actividad enzimática y la estabilidad de la proteína. [ 15 ]

Estructura

El monómero PAH (51,9 kDa) consta de tres dominios distintos: un dominio regulador N-terminal (residuos 1–117) que contiene un subdominio ACT de unión a Phe, el dominio catalítico (residuos 118–427) y un dominio C-terminal (residuos 428–453) responsable de la oligomerización de monómeros idénticos. Se ha realizado un extenso análisis cristalográfico, especialmente en el dominio catalítico coordinado con pterina y hierro para examinar el sitio activo. También se ha determinado la estructura del dominio regulador N-terminal y, junto con la estructura resuelta del dominio de tetramerización C-terminal homólogo de la tirosina hidroxilasa, se propuso un modelo estructural de PAH tetramérica. [ 13 ] Utilizando cristalografía de rayos X, se determinó experimentalmente la estructura de la PAH de rata de longitud completa y mostró la forma autoinhibida o de estado de reposo de la enzima. [ 16 ] La forma en estado de reposo (RS-PAH) es arquitectónicamente distinta de la forma activada (A-PAH). [ 17 ] Actualmente no se dispone de una estructura completa de A-PAH, pero se ha determinado la interfaz ACT-ACT estabilizada por Phe que es característica de A-PAH y se ha propuesto un modelo estructural de A-PAH basado en análisis SAXS. [ 18 ] [ 19 ]

Modelo de sitio activo para HAP.
Modelo del sitio activo de PAH unido a BH4, hierro ferroso y un análogo de fenilalanina. (de PDB 1KW0) Análogo de fenilalanina , BH4 , hierro , residuos de His y Glu coordinados con Fe(II)

Dominio catalítico

Las estructuras cristalinas resueltas del dominio catalítico indican que el sitio activo consiste en una cavidad abierta y espaciosa revestida principalmente por residuos hidrofóbicos, aunque también están presentes tres residuos de ácido glutámico, dos histidinas y una tirosina que se unen al hierro. [ 13 ] Existe evidencia contradictoria sobre el estado de coordinación del átomo ferroso y su proximidad a BH4 dentro del sitio activo. Según el análisis cristalográfico, Fe(II) está coordinado por agua, His285, His290 y Glu330 (una disposición de tríada facial 2-his-1-carboxilato) con geometría octaédrica. [ 20 ] La inclusión de un análogo de Phe en la estructura cristalina cambia tanto el hierro de un estado de seis a cinco coordinaciones que involucra una sola molécula de agua y una coordinación bidentada a Glu330 y abre un sitio para la unión del oxígeno. BH4 se desplaza concomitantemente hacia el átomo de hierro, aunque el cofactor pterina permanece en la segunda esfera de coordinación. [ 21 ] Por otro lado, un modelo alternativo basado en análisis de RMN y modelado molecular sugiere que todas las moléculas de agua coordinadas son expulsadas del sitio activo durante el ciclo catalítico, mientras que el BH4 se coordina directamente con el hierro. [ 22 ] Como se mencionó anteriormente, resolver esta discrepancia será importante para determinar el mecanismo exacto de la catálisis de HAP.

Dominio regulador N-terminal

La naturaleza reguladora del dominio N-terminal (residuos 1–117) se confiere por su flexibilidad estructural. [ 23 ] El análisis de intercambios de hidrógeno/deuterio indica que la unión alostérica de Phe altera globalmente la conformación de PAH de tal manera que el sitio activo está menos ocluido a medida que la interfaz entre los dominios regulador y catalítico se expone cada vez más al solvente. [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] Esta observación es consistente con los estudios cinéticos, que muestran una tasa inicial baja de formación de tirosina para PAH de longitud completa. Sin embargo, este tiempo de latencia no se observa para una PAH truncada que carece del dominio N-terminal o si la enzima de longitud completa se preincuba con Phe. La eliminación del dominio N-terminal también elimina el tiempo de latencia al tiempo que aumenta la afinidad por Phe en casi el doble; no se observa diferencia en la V max o K m para el cofactor tetrahidrobiopterina. [ 26 ] La Ser16 proporciona una regulación adicional; la fosforilación de este residuo no altera la conformación de la enzima, pero sí reduce la concentración de Phe necesaria para la activación alostérica. [ 25 ] Este dominio regulador N-terminal no se observa en los HAP bacterianos, pero muestra una considerable homología estructural con el dominio regulador de la fosfoglicerato deshidrogenasa, una enzima de la vía biosintética de la serina. [ 25 ]

Dominio de tetramerización

La PAH procariota es monomérica, mientras que la PAH eucariota existe en un equilibrio entre formas homotetraméricas y homodiméricas. [ 7 ] [ 13 ] La interfaz de dimerización está compuesta por bucles relacionados por simetría que unen monómeros idénticos, mientras que el dominio de tetramerización C-terminal superpuesto media la asociación de dímeros conformacionalmente distintos que se caracterizan por una orientación relativa diferente de los dominios catalítico y de tetramerización (Flatmark, Erlandsen). La distorsión resultante de la simetría del tetrámero es evidente en el área de superficie diferencial de las interfaces de dimerización y distingue a la PAH de la tirosina hidroxilasa tetraméricamente simétrica. [ 13 ] Se ha propuesto un mecanismo de intercambio de dominios para mediar la formación del tetrámero a partir de dímeros, en el que las hélices alfa C-terminales alteran mutuamente su conformación alrededor de una región de bisagra flexible de cinco residuos C-terminal para formar una estructura de bobina enrollada, desplazando el equilibrio hacia la forma tetramérica. [ 7 ] [ 13 ] [ 27 ] Aunque tanto las formas homodiméricas como las homotetraméricas de PAH son catalíticamente activas, ambas presentan cinéticas y regulación diferenciales. Además de una eficiencia catalítica reducida, el dímero no muestra cooperatividad positiva hacia L-Phe (que a altas concentraciones activa la enzima), lo que sugiere que L-Phe regula alostéricamente PAH al influir en la interacción dímero-dímero. [ 27 ]

Función biológica

La PAH es una enzima crítica en el metabolismo de la fenilalanina y cataliza el paso limitante de la velocidad en su catabolismo completo a dióxido de carbono y agua. [ 13 ] [ 28 ] La regulación del flujo a través de las vías asociadas a la fenilalanina es crítica en el metabolismo de los mamíferos, como lo demuestra la toxicidad de los altos niveles plasmáticos de este aminoácido observados en la fenilcetonuria (véase más adelante). La principal fuente de fenilalanina son las proteínas ingeridas, pero relativamente poca de esta reserva se utiliza para la síntesis de proteínas. [ 28 ] En cambio, la mayor parte de la fenilalanina ingerida se cataboliza a través de la PAH para formar tirosina ; la adición del grupo hidroxilo permite que el anillo de benceno se rompa en pasos catabólicos posteriores. La transaminación a fenilpiruvato , cuyos metabolitos se excretan en la orina, representa otra vía de recambio de la fenilalanina, pero el catabolismo a través de la PAH predomina. [ 28 ]

En humanos, esta enzima se expresa tanto en el hígado como en el riñón, y hay indicios de que puede estar regulada diferencialmente en estos tejidos. [ 29 ] La PAH es inusual entre las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos por su participación en el catabolismo; las hidroxilasas de tirosina y triptófano , por otro lado, se expresan principalmente en el sistema nervioso central y catalizan pasos limitantes de la velocidad en la biosíntesis de neurotransmisores/hormonas. [ 13 ]

Relevancia de la enfermedad

La deficiencia en la actividad de PAH debido a mutaciones en PAH causa hiperfenilalaninemia (HPA), y cuando los niveles de fenilalanina en sangre aumentan más de 20 veces la concentración normal, se produce la enfermedad metabólica fenilcetonuria (PKU). [ 28 ] La PKU es heterogénea tanto genotípica como fenotípicamente: se han identificado más de 300 variantes patogénicas distintas, la mayoría de las cuales corresponden a mutaciones de sentido erróneo que se mapean en el dominio catalítico. [ 13 ] [ 20 ] Cuando una cohorte de mutantes de PAH identificados se expresaron en sistemas recombinantes, las enzimas mostraron un comportamiento cinético alterado y/o una estabilidad reducida, consistente con el mapeo estructural de estas mutaciones tanto en los dominios catalítico como de tetramerización de la enzima. [ 13 ] BH4 4 se ha administrado como tratamiento farmacológico y se ha demostrado que reduce los niveles de fenilalanina en sangre para un segmento de pacientes con PKU cuyos genotipos conducen a cierta actividad residual de PAH pero no tienen defecto en la síntesis o regeneración de BH4 4 . Estudios posteriores sugieren que, en el caso de ciertos mutantes de PAH, el exceso de BH4 4 actúa como una chaperona farmacológica para estabilizar las enzimas mutantes con un ensamblaje de tetrámeros alterado y una mayor sensibilidad a la escisión proteolítica y la agregación. [ 30 ] Las mutaciones que se han identificado en el locus PAH están documentadas en la base de datos del locus de la fenilalanina hidroxilasa (PAHdb, https://web.archive.org/web/20130718162051/http://www.pahdb.mcgill.ca/ ).

Dado que la fenilcetonuria puede causar daños irreversibles, es fundamental detectar las deficiencias de la fenilalanina hidroxilasa en las primeras etapas del desarrollo. Originalmente, esto se hacía mediante un ensayo de inhibición bacteriana conocido como la prueba de Guthrie . Actualmente, la fenilcetonuria forma parte del cribado neonatal en muchos países, y los niveles elevados de fenilalanina se identifican poco después del nacimiento mediante espectrometría de masas en tándem . Una dieta baja en fenilalanina y alta en tirosina puede ayudar a prevenir daños a largo plazo en el desarrollo del individuo.

Modelo de eliminación de HAP

El primer intento de crear un modelo de ratón Pah -KO se informó en un artículo de investigación publicado en 2021. [ 31 ] Este ratón knockout se creó para ser homocigoto a través de su desarrollo dentro de la cepa C57BL/6 J usando CRISPR / Cas9 . [ 32 ] El codón 7, GAG, en el gen Pah se alteró al codón de parada TAG, lo que representa una mutación puntual intencional . Ratones homocigotos machos de dos a seis meses de edad fueron estudiados mediante métodos científicos tales como ensayos conductuales y bioquímicos, resonancia magnética e histopatología. Los ratones homocigotos fueron comparados rutinariamente con ratones de control, ratones Pah -KO heterocigotos de la misma edad y sexo que expresaban suficiente actividad de la enzima PAH para proporcionar niveles de fenilalanina y tirosina similares a los de los ratones de tipo salvaje .

El modelo de ratón Pah -KO presentó altos niveles de fenilalanina en sangre y bajos niveles de tirosina, hipocolesterolemia , altos niveles de fenilalanina y bajos niveles de neurotransmisores y tirosina en el cerebro, hipomielinización, bajo peso cerebral y corporal, alto grado de patología ocular, hipopigmentación y un déficit conductual progresivo en comparación con los ratones heterocigotos. [ 31 ] Después de la terminación de los ratones homocigotos, no se detectaron proteínas PAH hepáticas mediante análisis de Western blot . [ 33 ] La cantidad aumentada de fenilalanina en los homogeneizados de cerebro completo de ratones homocigotos fue similar a la de los pacientes con PKU. El color del pelaje de ambos ratones dependía de la cantidad de pigmento de melanina en los tallos del pelo; por lo tanto, los ratones homocigotos tendían a ser de un marrón más claro debido a la menor cantidad de melanina presente. El comportamiento de los ratones se evaluó con un ensayo de construcción de nidos. [ 31 ]

Este modelo ofrece la posibilidad de realizar una investigación exhaustiva de la biología de la fenilcetonuria (PKU) similar a la de los pacientes con PKU, así como de evaluar las estrategias terapéuticas modernas para el tratamiento de la PKU.

La fenilalanina hidroxilasa está estrechamente relacionada con otras dos enzimas:

Las tres enzimas son homólogas, es decir, se cree que evolucionaron a partir de la misma hidroxilasa ancestral.

Referencias

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Lecturas adicionales

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Lecturas adicionales

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  • "Base de datos específica del locus de las variantes del gen de la fenilalanina hidroxilasa humana" . BioPKU.org .
  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P00439 (fenilalanina hidroxilasa humana) en el PDBe-KB .